低氧诱导因子在急慢性肾脏病中的作用及相关药物治疗前景*

李煜，姚颖

(华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科，武汉 430030)

HIF是一种属于PER-ARNT-SIM (PAS)家族的异聚体蛋白质，在低氧条件下与缺氧反应元件(hypoxia response elements，HREs)结合。HIF由α和β亚单位组成，其中α亚单位的表达是氧依赖的，而β亚单位则是组成型表达。目前有3个已知的α亚单位(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和3个β亚单位(HIF-1β、HIF-2β和HIF-3β，也被称为ARNT1、ARNT2和ARNT3)[6]。HIF-1α在正常组织中广泛表达，HIF-2α是HIF-1α的同源物，它的表达受组织限制，在高度血管化的组织和器官中才可以检测到[7]。在肾脏中，HIF -1α在大多数肾小管上皮细胞中表达，而HIF-2α主要在肾间质成纤维样细胞和内皮细胞中表达。此外HIF -1α也在乳头和内髓的内皮细胞和间质细胞中检测到，但在外髓和皮质中尚未检测到[8]。

HIF系统受到脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHDs)的严格调节，PHDs是一种依赖2-氧戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)的双加氧酶家族的氧敏感酶，需要氧、铁和抗坏血酸共同作用才能发挥催化活性。在正常氧条件下，PHDs使HIF-α亚单位羟基化，在一个或两个脯氨酸位点上的羟基化导致HIF-α与肿瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，pVHL)结合，pVHL是泛素连接酶E3活性复合物的一部分，可导致快速泛素化和蛋白体降解[9]。PHDs一共有3种亚型，即PHD1、PHD2和PHD3。所有PHDs都在肾小管上皮细胞中表达[10]，特别是生理状态下氧张力较低的地方，如髓袢升支粗段、远曲小管和髓质内的集合管中高表达。除了PHDs，HIF-1抑制因子 (factors inhibiting HIF-1，FIH-1)也是一个重要的调节HIF的氧敏感酶。HIF-α可以被反式激活结构域中天冬酰胺残基上的FIH-1羟基化，从而破坏HIF-α和转录辅激活因子p300/CBP之间的相互作用，削弱剩余的HIF转录活性[11]。PHDs和FIH-1之间对氧气的亲和力略有不同，这意味着在低于生理氧浓度的情况下，PHDs的酶活性会先降低，当氧浓度进一步降低时将抑制FIH-1的活性，从而增加HIF的稳定性和功能[12]。FIH在肾脏的远端小管和足细胞中高表达，但部位不同似乎作用各异，在远端小管中可限制HIF-1α靶基因的表达，但对足细胞中的一些靶基因，如CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor-4，CXCR4)和血管内皮生长因子 A重组蛋白(recombinant vascular endothelial growth factor A，VEGFA)则具有潜在的HIF非依赖性转录效应[13]。

2 HIF相关靶基因及其在肾脏疾病中的作用

2.1HIF相关靶基因 HIF系统的调控十分复杂，根据外界空气或组织中氧的存在与否，数百个基因对HIF信号产生反应。其中红细胞生成、血管生成和糖无氧代谢分别受到EPO、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和糖酵解基因的调控，是肾脏损伤和修复中最重要的缺氧反应。

2.1.1红细胞生成 EPO是一种由肾脏和肝脏分泌的造血生长因子，通过促进骨髓中红细胞的生成进而增强血液的携氧能力。肾脏作为机体中重要的氧传感器对全身缺氧做出反应，然后通过肾皮质成纤维样细胞快速增加EPO的产生[14]。HIF可与EPO位点的调控DNA序列结合促进EPO的生成，除此之外HIF还可通过影响铁处理和代谢的基因，促进铁元素吸收及利用。CKD患者中往往存在着不同程度绝对性缺铁或功能性缺铁，这种铁的利用障碍受到铁调素的影响。铁调素通过抑制铁转运蛋白减少饮食中铁的吸收并阻止储存的铁从巨噬细胞和肝脏中释放，从而减少储存铁的利用和红细胞生成[15]。HIF还通过上调跨膜丝氨酸蛋白酶-6 (transmembrane serine protease-6，TMPRSS6)的表达而降低铁调素，TMPRSS6作为铁调素的负调节因子已被证明可以裂解铁调素调节蛋白(hemojuvelin，HJV)，进而降低膜上可结合的HJV，减少铁调素的表达[16]。

2.1.2血管生成 缺氧时VEGF的表达主要受HIF-1α调节，VEGF是最有效的内皮特异性有丝分裂原，它招募内皮细胞进入缺氧和无血管区，通过激活酪氨酸激酶受体直接参与血管生成并刺激其增殖[17]。肾脏中肾小球的功能依赖于VEGF，当足细胞来源的VEGF在肾小球中过度表达可能会导致肾小球的塌陷[18]。然而抑制足细胞来源的VEGF表达会破坏肾小球滤过屏障，导致蛋白渗漏和肾小球血栓性微血管病[19]。

2.1.3葡萄糖代谢 根据灌注情况的不同，肾脏中特别是肾皮质的氧气供应会有很大的不同。其中小管细胞通过糖酵解产生ATP的能力非常有限，导致在维持氧化代谢过程中快速消耗和高度依赖氧气。这使肾脏在缺血、缺氧状态下容易受到损伤。HIF主要通过激活葡萄糖转运蛋白(glucose transporters，GLUT)1和3的转录来促进葡萄糖摄取，同时增强糖酵解过程中能量的产生。但实际上它同时上调了大多数糖酵解酶，包括己糖激酶1/2(hexokinase1/2，HK1/2)、烯醇化酶(enolase1，ENO1)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase1，PGK1)和M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase，PKM2)。此外HIF还增加了促进乳酸合成和排泄的蛋白质，如乳酸脱氢酶(LDH)、单羧酸转运体(monocarboxylate transporters 4，MCT4)[20]。并且HIF还可刺激丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK1)和Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 (recombinant Bcl2/adenovirus E1B interacting protein 3，BNIP3)的表达，降低线粒体氧消耗和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[21]。

2.2HIF与AKI AKI是由多种原因引起肾功能短时间内肾功能突然下降。越来越多的证据表明肾缺氧是不同病因所致AKI的共同特征，细胞缺氧在AKI中致病作用受到了越来越多的关注。在生理状态下较低的外髓质的氧张力下降可迅速导致能量剥夺，从而造成细胞损伤。肾缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是引起AKI的主要原因之一，许多研究已经证实HIF在IRI中发挥重要作用。PHDs抑制剂通过激活HIF-1α及HIF-2α，继而上调相关HIF靶基因以减少细胞凋亡、巨噬细胞浸润和血管细胞粘附分子1 (vascular cell adhesion molecule，VCAM1)的表达，最终减轻肾脏损伤[22]。在IRI后6 h给予粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)也可以激活HIF，继而上调VEGF和EPO的表达，减轻肾组织损伤程度[23]。但也有部分研究显示在肾缺血后给予PHDs抑制剂并不能减轻AKI[24]。

此外microRNAs也被证实在缺血性AKI中发挥重要作用。一方面HIF可诱导microRNA-489相关靶基因保护肾近端小管、诱导microRNA-668抑制MTP18的表达而保护线粒体动力学、下调microRNA-127-3p的表达促进Ⅰ型胶原和α-SMA的诱导和E-钙粘蛋白的丢失[25-27]，多方面作用均使得microRNAs在缺血性AKI中起到保护肾功能的作用。另一方面HIF也可诱导microRNAs的表达而加重损伤。研究显示通过阻断microRNA-687促进PTEN的表达，减少了肾细胞的凋亡和细胞周期激活继而减轻肾损伤。在缺血性AKI中HIF诱导microRNA-687在近端小管细胞中表达增加，可能会加重肾损伤[28]。虽然HIF在AKI中详细的作用机制尚未明了，但以上研究均显示出HIF在缺血性AKI中的重要作用，有希望成为新的治疗靶点。细胞毒性则是导致AKI另一个重要病理因素，在感染性疾病中也可引起AKI，全身炎症反应可以由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或其他微生物成分进入淋巴和循环系统引起。有研究表明磷酸化的NF-κB、p65、HIF-1α在LPS诱导的肾损伤中同时过表达，而EPO通过降低HIF-1α和NF-κB的表达来减轻败血症所致AKI[29]。顺铂是一种常见的容易引起AKI的化疗药物，其对肾脏的毒性主要与肾小管的凋亡、炎症和坏死有关。在一项应用HIF-脯氨酰羟化酶抑制剂(HIF-PHI)对顺铂诱导的AKI小鼠肾功能和形态学影响的研究中，发现用顺铂处理的小鼠其肾脏病理特征为肾小管扩张、管状细胞坏死和蛋白管型；HIF-PHI治疗后这些组织学变化明显减轻，并且在治疗过程中HIF-PHI对小鼠的肾功能及肾脏形态方面没有明显的副作用[30]。

2.3HIF与肾脏修复及纤维化 在发生AKI后肾脏有能力修复受损的肾小管，根据受损的严重程度可分为完全性修复和不完全修复。其中不完全修复以未分化和萎缩的肾小管和持续性炎症为特征，导致肾间质纤维化并在未来可能进展为CKD[31-32]。在IRI过程中HIF通过促进组织修复基因的表达，成为近端上皮细胞再生的关键因子[33]。HIF通过上调EPO刺激细胞再生、抑制凋亡细胞死亡来增强组织修复[34]，并诱导基质细胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor-1，SDF-1)促进祖细胞的募集以再生组织[35]。在残肾模型中，HIF的活化增加了增殖的肾小球和管周内皮细胞的数量来保护管周毛细血管网。HIF在残肾模型中被证实可以减轻肾小管间质损伤和减少纤维化[36]。KAPITSINOU等[37]证实，在IRI缺血前通过PHD抑制剂GSK1002083A激活HIF可改善AKI诱导的纤维化，但缺血后再应用PHD抑制剂对肾纤维化没有影响。进一步的研究证实HIF在残肾模型中对肾脏的保护作用依赖于HIF激活的亚型和不同的时机，在早期给予PHD抑制剂可加速肾纤维化，而晚期用药则减轻肾纤维化[38]。早期给予PHD抑制剂同时激活了HIF-1α和HIF-2α，而晚期予以PHD抑制剂只激活了HIF-2α，对HIF-1α没有影响[39]。同时HIF的激活效应可能是激活的细胞类型特异性有关。在单侧输尿管梗阻模型中，肾近端小管特异性HIF-1的抑制可减少纤维化和炎症，而髓样细胞源性HIF则在大鼠急性梗阻性肾损伤模型中展现出相反结果[40]。

2.4HIF与CKD CKD目前已成为全球重要的公共健康问题，据统计全球CKD平均患病率13.4%，中国CKD患病率高达10.8%[41]。贫血是CKD患者的常见并发症之一，美国国家健康和营养调查报告显示美国CKD患者贫血发生率是普通人群的2倍，CKD3期患者的贫血发生率已接近50%[42]。有资料表明中国非透析CKD患者肾性贫血患病率为51.5%，透析患者则高达98.2%。贫血增加CKD患者心血管风险和死亡风险，是CKD合并心血管并发症的独立危险因素。由于缺氧环境下HIF可促进红细胞生成，调控HIF-PHD轴成为治疗贫血的新方向。低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶抑制剂(HIF-PHI)是一类通过在常氧状态下抑制PHDs的活性使得体内HIF积累从而发挥作用的一类药物。在已发表的Ⅱ期临床试验中，HIF-PHI疗法在非透析依赖性的CKD(non-dialysis-dependent chronic kidney disease，NDD-CKD)和透析依赖的CKD(dialysis-dependent CKD，DD-CKD)患者中升高血红蛋白水平的效果至少与传统促红细胞生成素刺激剂(erythropoietin stimulating agents，ESA)疗效相同，同时在HIF-PHI的治疗过程中还观察到它可以降低患者血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平[43]。其作用机制可能是HIF在糖酵解过程中刺激丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)的表达，而PDK可抑制丙酮酸脱氢酶复合物阻止丙酮酸转化为乙酰CoA，从而减少了胆固醇合成的原料；同时HIF-1通过胰岛素诱导基因-2(insulin inducible gene-2，INSIG-2)途径激活INSIG-2转录，导致INSIG-2蛋白的积累并与HMG CoA还原酶(HMGCR)结合，促进(HMG CoA reductase，HMGCR)的泛素化与降解[44]。此外HIF还参与调节体内神经酰胺水平，在肠道中神经酰胺主要通过直接或间接调节CD36和SREBP1C信号通路上调脂肪酸的摄取和合成。HIF-2α通过结合HRE1直接上调Acer2基因的表达促进神经酰胺分解代谢，从而降低胆固醇[45]。关于HIF-PHI在肾脏病中更多的应用有待于更多的临床数据支撑。

3 HIF-PHI药物临床研究现状

HIF-PHI是CKD患者治疗贫血的一项新选择，这种新型小分子口服药物通过抑制PHDs的活性模拟缺氧，使得HIF-α增加，进而导致内源性EPO水平和铁利用率升高来治疗贫血[46]。目前正处于临床研究的药物主要包括罗沙司他、达普司他(daprodustat)、molidustat、desidustat、enarodustat、vadadustat等等，罗沙司他是国内首个获批用于治疗血液透析或腹膜透析患者贫血的HIF-PHI，2020年第2个HIF-PHI新药获批在日本上市，用以治疗肾性贫血。其中罗沙司他在透析、非透析CKD患者的临床试验中均显示可以提高血红蛋白和EPO，降低铁调素水平，在研究过程中显示出良好的耐受性，没有增加心血管事件发生率及死亡率。主要的不良反应表现为高血压及转铁蛋白饱和度降低[47]。在一篇关于HIF-PHI治疗NDD-CKD患者贫血的安全性和有效性Meta分析中，结果显示了8项使用HIF-PHI与安慰药对照的临床试验，HIF-PHI显著改善了NDD-CKD患者的Hb值(P<0.00001)，同时铁蛋白、铁调素均有显著性差异。与安慰药组相比不良反应率并无统计学差异。HIF-PHI组铁蛋白显著性降低并不代表NDD-CKD患者出现缺铁，由于CKD患者常伴随着铁利用障碍、绝对或相对性缺铁，转铁蛋白饱和度(TAST)可能是更好评价患者是否缺铁的指标[48]。在未予补铁治疗的CKD患者中发现每周3次口服罗沙司他可以显著提高血红蛋白水平，同时不需要对该人群短期内给予补铁治疗[49]。 罗沙司他与EPO在透析患者中的疗效和安全性对比中，使用罗沙司他组主要的不良反应表现为高钾血症和代谢性酸中毒，而EPO组主要的不良反应表现为高血压[50]。达普司他是葛兰素史克公司开发的HIF-PHI，它可以抑制3种PHD，但优先选择PHD1和PHD3，并且稳定HIF-1α和HIF-2α。达普司他在与安慰药对照的CKD 3-5期和透析患者临床试验中观察到患者接受持续4周，每天0.5～100 mg的药物治疗，在短期内达普司他可在不增加不良反应的情况下改善了贫血和提高铁的利用率。达普司他的主要不良反应是恶心、腹痛、消化不良。在接受每天100 mg持续4周的治疗过程中，60%患者出现了不良反应，因此不良反应的发生可能与较大剂量有关[51]。达普司他在每周3次10～30 mg的不同给药剂量中提高血红蛋白的水平呈现为剂量依赖型，同时在每周3次30 mg给药时没有发现新的安全性问题[52]。至于molidustat、 desidustat、enarodustat、vadadustat等HIF-PHI制剂在与安慰药相比的研究中，除vadadustat外，其他HIF-PHI均在增加Hb水平方面显著优于ESA，且没有发现HIF-PHI增加全因死亡率风险。这些结果支持了HIF-PHI在CKD患者贫血治疗中的应用[53]。以往使用ESA治疗CKD患者贫血过程中为了达到较高的血红蛋白目标水平可能伴有大剂量的ESA使用，增加了患者EPO抵抗和心血管事件的风险，而HIF-PHI通过内源性增加EPO并使其维持在生理水平是使用HIF-PHI的一个显著优势，它可以避免EPO过载，这可能有助于减少CKD患者心血管事件的发生率。另外由于HIF-PHI上调参与血管生成和肿瘤生长的其他缺氧敏感基因，在长期干预过程中的肿瘤风险值得我们关注，需要更长时间的随访观察证实其安全性[54]。

4 展望

HIF对体内的氧稳态系统调节起着重要调控作用，通过调节糖、脂代谢，细胞增殖、血管生成等方面激活诱导内源性缺氧防御机制的能力，因此通过靶向激活HIF有很大的治疗潜力。目前有研究表明缺氧时细胞的外泌体对肾小管细胞损伤有保护作用，HIF在缺氧时可促进肾脏近端小管外泌体的产生并能抑制ATP耗竭后的小管细胞凋亡，有助于外泌体对细胞的保护作用。外泌体是细胞产生和分泌的纳米大小的囊泡，它的内容物包括不同的蛋白质、RNA、DNA和其他类型的分子。通过运输到其他细胞释放它们的内容物从而介导细胞间通讯，但现在外泌体在肾脏组织和细胞中的产生机制和功能仍不完全清楚[55]。此外，髓样细胞源性的HIF被证明在单核细胞聚集并活化的肾脏炎症性损伤中起关键作用，激活HIF可以抑制肾脏中的炎症反应，是否可以通过药物靶向激活HIF从而控制炎症需要进一步研究[56]。

当前虽然已经批准罗沙司他及达普司他上市用于治疗肾性贫血，但这两个药物均为非选择性PHD抑制剂，而3种PHD亚型具有不同的特征包括对HIF-α亚型的目标选择性和细胞类型中的表达水平均有不同。若能开发特异性PHDs抑制剂的药物有望更安全。此外，罗沙司他对顺铂诱导的小鼠AKI模型能改善肾脏损伤、凋亡和炎症[30]，这有可能扩大HIF-PHI在贫血治疗以外的急性肾损伤治疗中的临床应用。同时由于HIF-2α直接调控神经氨酸酶3(neuraminidase 3，Neu3)的表达从而调节神经酰胺和脂肪酸的合成，HIF-2α-NEU 3-神经酰胺轴成为治疗的潜在靶点。PT2385是一种口服生物可利用的HIF-2α拮抗剂，通过变构阻断HIF-2α和HIF-β之间的异二聚化作用，特异性抑制HIF-2α的转录活性。研究证实PT2385在小鼠中通过抑制肠道HIF-2α信号可显著预防和逆转肥胖和肝脂肪变性，随后降低肠道和血清神经酰胺水平[57]。

迄今为止其他正在进行早期研究的大多数抑制剂都是HIF-1α的间接抑制剂，目前报道最多的是金刚烷基和硼基抑制剂。金刚烷基衍生物LW6是一种线粒体苹果酸脱氢酶2抑制剂(mitochondrial malate dehydrogenase 2，MDH2)，可降低HIF-1α的聚集而不影响HIF-1α mRNA水平和HIF-1β的表达。硼基抑制剂GN26361通过抑制VEGF mRNA的表达而不影响HIF-1α mRNA的表达来抑制HIF-1α蛋白积累[58]。

鉴于HIF的调节途径和机制十分复杂，高达1%的基因对缺氧敏感，而HIF长期、过度抑制可能影响重要的生理过程和正常组织，因此如何更加准确地进行HIF靶向精准调控将是未来努力的重要方向。