心肌细胞钙稳态失调在心力衰竭中作用的研究进展

刘峰宇，韩 薇

(哈尔滨医科大学附属第一医院 心血管内科，黑龙江 哈尔滨 150000)

心力衰竭(heart failure)是各种心脏疾病的终末期阶段，其病死率和再住院率居高不下。近年来心力衰竭治疗药物和设备不断取得进展，但中国心力衰竭患病率依然呈持续升高趋势[1]。心力衰竭的机制复杂多样，至今尚未完全阐明，因此，迫切需要进一步的认知及新的治疗方案。本综述从分子水平上阐述心肌细胞钙稳态机制及其与心力衰竭的关系，识别在发病过程中影响钙稳态的关键蛋白，为心力衰竭的诊疗提供潜在靶点和新的策略。

1 心肌细胞钙稳态的生理特性

钙作为第二信使，具有多种信号传导作用，参与从肌肉收缩到细胞死亡的各种过程。这些过程的发生，依赖于通过钙通道、ATP酶泵、离子转运体和交换器与钙结合蛋白等协同工作。心肌细胞的收缩功能受兴奋-收缩耦联(excitation-contraction coupling,ECC)的调控。收缩过程中，动作电位引起细胞膜去极化，使少量的细胞外钙通过电压门控的L型钙通道(L-type calcium channel，LTCC)进入胞质。这种钙与2型兰尼碱受体(ryanodine receptor 2,RyR2)结合，形成钙火花，引发肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)内钙通过RyR2短时间大量外流入胞质，产生钙瞬变，这个过程被称为钙诱导钙释放(calcium induced calcium release,CICR)。细胞内钙浓度增加约10倍，激活钙敏感的收缩蛋白(肌钙蛋白C，troponin C,Tn-C)，Tn-C利用线粒体所产生的ATP产生肌肉收缩。舒张期钙主要通过钠钙交换器(sodium-calcium exchanger，NCX)和质膜钙ATP酶(plasma membrane calcium ATPase,PMCA)从胞质中排出，约30%被转运出细胞，70%通过心脏肌/内质网钙ATP酶2a(sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a,SERCA2a)泵回SR。

心肌细胞线粒体供能对维持钙稳态，以保障正常的收缩功能至关重要。此外，线粒体在介导细胞信号和细胞死亡途径方面也发挥重要作用。线粒体的功能需要线粒体内钙的参与[2]，线粒体钙单转运体(mitochondrial Ca2+uniporter，MCU)是线粒体钙摄取的主要途径，其活性依赖于细胞内钙浓度；线粒体钙从基质中排出是通过线粒体钠钙(Na+/Ca2+)交换器(MNCX)、MCU的反转和/或线粒体内膜的通透性转变来完成的。

2 心力衰竭时钙稳态的病理性改变

钙处理和转运蛋白障碍导致细胞钙瞬变振幅降低，持续时间延长，其结果是心肌收缩性降低，心输出量减少。钙处理蛋白的改变也会损害心脏传导性，导致致命性心律失常[3]。下文从过量钙进入胞质、肌质网膜钙摄取降低、肌质网钙含量减少以及钙从肌质中渗漏等方面讨论心肌细胞在心力衰竭过程中的钙稳态失调。

2.1 细胞膜钙转运障碍

2.1.1 L型钙通道:在人类心肌细胞中，胞质钙内流几乎全部通过LTCC发生。在心力衰竭期间，LTCC的磷酸化增加，衰竭的心肌细胞中结构组织丧失导致功能性LTCC从T管重新分布到肌膜[4]。Junctophilin-2(JPH2)是心肌细胞膜横向T管与RyR2间形成的膜耦联复合物(JMCs)的主要结构蛋白之一，在JPH2连接区域中诱导突变的JPH2(mutPG1JPH2)引起T管重塑，表明LTCC和JPH2之间的相互作用对于T管稳定至关重要[5]。在心脏病动物模型中，使用钙通道阻滞剂可防止或逆转病理性心脏重构。然而，临床实验中，非二氢吡啶类钙通道阻滞剂增加射血分数减低型心力衰竭患者病死率和迟发性心力衰竭的发生率，这与钙通道阻滞剂的负性肌力作用及神经内分泌的激活相关。

2.1.2 钠钙交换器:NCX是一种膜转运蛋白，是真核细胞内钙稳态调节的主要分子之一。生理情况下以正向模式工作，3个Na+进入细胞，1个Ca2+排出细胞。在心力衰竭期间，心肌细胞内Na+浓度上升，使NCX反向工作，导致在舒张期细胞内钙外流减少，同时减缓钙瞬变衰减速率，继而导致胞质钙超载。NCX的体外过表达损害心肌细胞的收缩功能。在心力衰竭动物模型中，神经调节蛋白(neuroglin-1β)的应用抑制NCX1的增加[6]，NCX慢性抑制剂SEA0400及ORM-11035的应用可维持心肌细胞钙稳态，改善离体及在体心脏的舒张功能，抑制心室重构的发生[7]。

2.1.3 钙库操作性钙离子通道:钙库操作性钙离子通道((store-operated calcium entry，SOCE)是介导胞外Ca2+进入细胞内的重要通道之一，其核心由定位于内质网上的基质相互作用分子(stromal interaction molecule，STIM)和定位于细胞膜上的Ca2+选择性通道Orai蛋白构成[8]。SOCE可以感知细胞内钙耗竭并开放通道允许细胞外钙内流，这一过程在心力衰竭的病理重塑过程中被加强。在主动脉缩窄所致心力衰竭的小鼠模型中，Orai1表达增加并出现Orai1依赖性SOCE开放，Orai1抑制剂的应用对心力衰竭小鼠产生保护作用[9]。表明抑制SOCE过度开放是治疗心脏收缩功能障碍的一种潜在的有效治疗方法。

2.2 肌质网与钙稳态

2.2.1 肌/内质网钙ATP酶2a:SERCA2a是心肌细胞钙循环过程的关键蛋白，在心力衰竭的动物模型和患者中，SERCA2a的表达和活性均降低。SERCA2a敲除大鼠表现出明显收缩功能障碍。

SERCA2a的生理功能受到多种蛋白的调控。PLN对SERCA2a活性的调控至关重要，PLN是肌浆网中的一种小磷蛋白，在心肌细胞中可逆地抑制SERCA2a，从而减少钙离子流入SR。PLN可被钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)或蛋白激酶B(Akt)磷酸化。当PLN一或两个位点被磷酸化时，其对SERCA2a的抑制作用减轻。心力衰竭期间心脏PLN蛋白的表达没有变化，由于SERCA2a表达减少致PLN/SERCA2a比值升高，导致PLN对SERCA2a抑制增强。SERCA2a的翻译后修饰对其活性影响同样重要，小的泛素样修饰物1(SUMO1)过表达可增加SERCA2a的SUMO蛋白质修饰化，改善心力衰竭小鼠及猪的心脏功能[10]。

2.2.2 兰尼碱受体(RyR2):RyR2介导的钙从SR释放到胞质是兴奋收缩耦联过程中的关键事件。在肌肉舒张过程中，RyR2通道必须保持紧密闭合，以便SR钙库得到补充。在心力衰竭期间，RyR簇被破坏，导致较慢的Ca2+释放动力学和舒张期Ca2+泄漏[11]。增加的β-肾上腺素能信号导致cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)在Ser28088及Ser2030位点过度磷酸化RyR2，导致其与通道稳定蛋白FKBP12.6的结合受损，RyR2的开放概率增加并在舒张期从SR泄漏钙。在消融PKA心脏中，RyR2在两位点均不能被磷酸化[12]。依赖于CaMKII的RyR2磷酸化也是心力衰竭中钙通道活性的重要调节器。心力衰竭患者CaMKII水平升高以及依赖CaMKII的RyR2磷酸化增加，可能是舒张期SR钙释放增加的另一种机制。

2.2.3 肌质网钙缓冲蛋白:肌质网内的钙缓冲蛋白在EC耦联过程中起重要作用。心肌肌质网中主要的钙缓冲蛋白是钙固缩蛋白异构体2(calsequestrin 2，CASQ2)，其通过降低肌质网内游离钙离子浓度来促进SERCA2a在舒张期摄取钙离子，保证收缩期时肌质网内有足够的钙储备。CASQ2在mRNA和蛋白水平在心力衰竭中没有改变，但在CASQ2敲除小鼠中上调肌质网对钙的摄取导致心肌肥厚、收缩功能障碍与早期死亡率增加。

另一种认为在钙吸收和释放中起作用的肌质网钙结合蛋白，是组氨酸丰富钙结合蛋白(histidine rich calcium binding protein,HRC)。在心脏肌质网的管腔中发现的HRC已经被证明通过连接素(一种辅助膜蛋白)与SERCA2a和RyR2相互作用，这表明它与钙稳态的调节密切相关。在心力衰竭动物模型中，非典型激酶Fam20C可以介导HRC、CASQ2及STIM1磷酸化，在维持心肌细胞钙稳态中起重要作用[13-14]。

2.2.4 线粒体与钙稳态:线粒体是心肌收缩所需的ATP形式的主要能量来源，Ca2+对线粒体功能调控至关重要。线粒体钙稳态失调会损害线粒体功能，从而加重心力衰竭。线粒体基质中的[Ca2+]受MCU严格调控[15]。在衰竭的人类心脏和心力衰竭动物模型中，MCU水平升高[16-17]。但心力衰竭中线粒体钙如何变化尚有争议。

一方面认为线粒体钙在心力衰竭中减少，其观点主要包括以下4方面：1)心力衰竭心肌细胞SR钙释放速率和幅度的降低，降低线粒体对钙的摄取；2)心力衰竭时NCX反向工作，但NCX介导的Ca2+内流在触发线粒体Ca2+摄取方面效率较低。3)MNCX活性的决定因素是跨线粒体膜的钠浓度梯度，在衰竭的心肌细胞中，升高的[Na+]加速线粒体Ca2+排出。4)心力衰竭时SR-线粒体Ca2+微域本身的结构也受到干扰，包括T管重塑，线粒体的异常聚集和连接SR的无序结构。

另一方面认为心力衰竭时线粒体钙超载，在心肌梗死心力衰竭小鼠模型中，线粒体Ca2+超载，通过抑制线粒体Ca2+外流加重心力衰竭，而过表达NCLX可改善心力衰竭。这种相悖的理论及实验结果可能是因为不同动物种类离子通道生理特性的差异，或各类心力衰竭模型中线粒体钙稳态失调与心力衰竭发生的先后顺序的不同，其潜在机制有待进一步研究。

3 钙稳态失调的治疗

对正常和病理状态心肌细胞钙转运和信号的理解使得针对钙处理蛋白治疗的发展成为可能。治疗的方向主要集中在通过增加肌质网钙摄取或防止肌质网钙泄漏，以改善肌质网功能以维持钙稳态。

3.1 增加肌质网钙摄取

在心力衰竭期间，SERCA2a的表达和活性降低。在阿霉素诱导的大鼠心力衰竭模型中，应用比索洛尔可提高SERCA2a活性从而改善心功能[18]。将SERCA2a基因转移到衰竭的人心肌细胞中可改善其收缩功能，在多种心力衰竭模型动物应用腺相关病毒(AAV)心脏特异性过表达SERCA2a治疗取得疗效并评估安全性后后，2008年进行了首项人转基因治疗心力衰竭临床实验。CUPID(calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease)是第一项应用AAV1过表达SERCA2a治疗晚期心力衰竭患者的临床实验，SERCA2a过表达可改善患者心力衰竭症状和/或延缓心力衰竭的进展，且对心脏的保护作用与治疗的剂量呈正相关。然而，在后来的CUPID2及AGENT-HF实验结果显示，AAV1/SERCA2a并没有改善心力衰竭和射血分数降低的患者的临床病程[19]。这一阴性结果可能是源于研究纳入的患者心脏对载体的传递和摄取不足。后续SERCA-LVAD研究在应用左室辅助装置患者心脏中应用AAV1过表达SERCA2a，在CUPID2报告中性结果后试验终止，同样取得阴性结果[20]。SERCA2a基因过表达治疗心力衰竭领域，安全性已得到证实，其治疗方案及后续效果有待进一步探索。

针对SERCA2a的翻译后修饰，近年不断取得进展。SUMO1和S100A1的基因转移均能促进SERCA2的活性，改善心力衰竭啮齿动物和猪的心脏功能。SIRT1(sirtuin-1，III类组蛋白去乙酰化酶1)与p300(一种组蛋白乙酰转移酶)在赖氨酸493位点去乙酰化，可恢复SERCA2a活性[21]。硝基氧基(HNO)通过直接翻译后修饰靶蛋白(尤其是心肌细胞中的SERCA2a，PLN)上的巯基残基，提高心脏收缩能力[22]。BMS-986231是一种HNO供体，其临床应用安全性及治疗效果在StandUP-AHF，StandUP-Imaging和StandUP-Kidney等II期临床实验中初步验证[23]。

3.2 防止肌质网钙泄漏

过度磷酸化或不稳定的RyR2通道导致肌质网在舒张期钙渗漏，导致SR钙含量降低和收缩期钙瞬变减少，进而导致收缩性降低和心输出量减少。抑制PKA或CaMKII过度磷酸化RyR2的一种治疗策略是过表达RyR2调节蛋白FKBP12.6。FKBP12.6在小鼠心脏特异性过表达，或腺病毒介导的离体兔心肌细胞导致RyR2稳定，增加肌质网钙含量，并改善心肌细胞收缩性。

一些部分抑制RyR2活性的药物(氟卡胺、卡维地洛)可以减少舒张期钙渗漏。丹曲林作为一种恶性高热急性期治疗药物，用于心力衰竭期间，可选择性地减少舒张期Ca2+泄漏，且不会抑制收缩期间的Ca2+释放，验证其对慢性心力衰竭患者的安全性和有效性的临床实验“SHO-IN”(日本临床试验注册证标识符61180059)正在进行[24]。与丹曲林同属于海因衍生物的苯妥英钠亦可有效抑制RyR2介导的Ca2+释放，其抑制作用与丹曲林相当，且具有更好的安全性[25]，但其在心力衰竭以及心律失常患者中的应用仍需临床研究进一步验证。一种新型药物Rycals，可通过变构机制阻止RyR2的解离以稳定RyR2通道，从而减少SR的Ca2+泄漏。Rycals治疗RyR1相关性肌病的临床试验(clinicaltrials.gov标识符NCT04141670)正在进行中，鉴于其特殊的药理作用，今后有望应用于心力衰竭治疗领域。

4 问题与展望

钙稳态的维持受复杂网络调控，而钙稳态受损是心力衰竭的一个关键特征，其导致心肌收缩功能障碍和心律失常的发生。心力衰竭时钙稳态缺陷最常见的原因为钙离子转运蛋白、结构蛋白、离子通道以及酶的表达及功能改变，导致细胞质钙超载，肌质网内钙含量减少。许多实验结果促进了对这些途径的理解，针对改善钙稳态缺陷的治疗方法近年来不断发展，目前在动物模型和临床实验中已取得成效，但由于药物不良反应的影响，以及对钙稳态机制认识不足，限制了部分实验结果向临床的进一步转化。随着对机制的认识深入以及治疗方法的探索，维持心肌细胞钙稳态在未来对心力衰竭的治疗中将取得更大进展。