靶向剪切力敏感关键分子的动脉粥样硬化防治研究

赵川榕，周 菁

(北京大学 基础医学院 生理学与病理生理学系；教育部分子心血管重点实验室；国家卫生健康委员会心血管分子生物学与调节肽重点实验室；心血管受体研究北京市重点实验室，北京 100191)

血流动力学因素中不规则的剪切力与粥样硬化等血管病理改变密切相关：在大动脉弯曲和分叉处的扰流，对血管内壁产生较低、多向且不规则的剪切力，通过诱导血管炎性反应和内皮细胞过度增殖与凋亡等内皮功能障碍，可促进动脉粥样硬化的形成；而在大动脉长、直段的层流所产生的单向且规则的高剪切力，可以刺激内皮细胞产生支持细胞生存和屏障功能的因子，并抑制凝血、白细胞浸润和血管平滑肌细胞增殖，可以避免产生动脉粥样硬化[1]。血流扰动如何诱导内皮功能障碍及该过程中涉及的关键分子和途径，是血管力学生物学研究中备受关注的问题。内皮细胞通过机械传感和机械转导，可以有效地将力学信号转化为化学信号，从而激活一系列对机械力敏感的转录因子，改变基因的表达，最终影响内皮细胞的反应、结构和功能[2]。这些受到流体剪切力调控的因子，可能是动脉粥样硬化等内皮细胞功能障碍性疾病的预防和治疗的关键靶点[3]。近年来有许多研究表明，多种药物可以通过剪切力敏感的因子通路调节和改善内皮细胞的功能。因此，本文就部分剪切力敏感的转录因子或转录辅助因子作为预防和治疗动脉粥样硬化的未来药物开发的新方向进行综述。

1 经典转录因子调控通路及靶向治疗

1.1 KLF家族

KLF2和KLF4是Krüppel样因子(Krüppel-like factor, KLF)家族含有锌指结构的转录因子，介导内皮细胞中抗炎、抗氧化和抗血栓基因的表达调控。持续的高速层流剪切力(12 dyn/cm2)和单向的脉冲剪切力[(12±4)dyn/cm2]能够通过MEK5/ERK5/MEF2信号通路持续诱导KLF2及其相关基因KLF4的表达[4]。KLF2是一种血管保护性转录因子，在维持内皮细胞稳态和静态表型方面起着关键作用。KLF4同样也是非常重要的血管保护性转录因子，它也调控了内皮细胞中和KLF2重叠的一些基因例如一氧化氮合成酶3(NOS3)、凝血调节蛋白(THBD)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)、血管细胞黏附因子1(VCAM1)的表达[5]。

已经报道的能够激活或增加KLF2或KLF4表达的药物有他汀类、白藜芦醇、异羟肟酸(SAHA)、植物多酚鞣酸(TA)、植物黄酮漆黄素，以及糖尿病的特效药二甲双胍等[6]。

1.2 NF-κB

核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一种普遍存在的转录因子，参与炎性反应、免疫和发育过程。在内皮细胞中，主要表达的是由p50和p65组成的二聚体形式，当其定位于细胞质时，与抑制蛋白(I-κB)结合，呈不激活的状态[7]。低而振荡的扰流诱导NF-κB激活，可以与位于多种基因启动子上的剪切力响应元件(SSRE)结合，激活下游多种基因的表达上调。NF-κB对内皮细胞炎性反应具有直接的调控作用，许多转录因子信号传导通路都会通过影响NF-κB的活性而达到影响内皮细胞炎性反应的作用[8]。因此NF-κB通路在剪切力调控的内皮细胞炎性反应中具有非常重要的意义。

天然的NF-κB选择性或特异性抑制剂被证明是有前途的抗动脉粥样硬化、抗炎、抗血管增生和凋亡的有效治疗途径，可以减少动脉粥样化的形成并防止其并发症，例如番茄红素、芹黄素、穿心莲内酯、长春西汀、雷公藤甲素、川皮苷等[8]。除此之外，许多化合物例如地高辛、糖皮质激素、阿司匹林、雷帕霉素等也能够通过抑制NF-κB的活性从而抑制内皮细胞的炎性反应。NF-κB作为内皮细胞炎性反应的重要通路，是各类心血管系统疾病保护与治疗药物的主要研究靶点之一。

1.3 YY1

锌指转录因子阴阳-1(Yin Yang 1, YY1)是一种多功能蛋白，可以根据辅助因子、上下游启动子和染色质结构激活或抑制基因表达。人类YY1由414个氨基酸残基组成，包括一个反式激活和抑制结构域和4个C2H2型锌指结构域[9]。预测YY1参与了大约10%的哺乳动物基因的转录控制，这表明YY1在基因调控网络中起着重要作用。YY1可以与多种转录因子相互作用，包括SP1、HOXA11和HDACs[10]。近期有研究[11]指出，在低且振荡的扰流条件下，通过磷定量蛋白组学分析发现，YY1第118位丝氨酸呈现高磷酸化，从而促进内皮细胞的增殖与动脉粥样硬化的发生。因此内皮细胞中磷酸化的YY1可能是一个很有前景的分子靶点，用于治疗与内皮功能障碍相关的血管疾病，如动脉粥样硬化。

四溴肉桂酸(TBCA)与阿托伐他汀均能够抑制YY1的磷酸化，并减少动脉粥样硬化斑块的形成[11]。而其他YY1抑制剂如NO供体S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺(SNAP)和3,3-二(氨乙基)-1-羟基-2-羰基-1-三氮烯(DETA NONOate)、桦木酸、利妥昔单抗、以及蛋白酶体抑制剂NPI-0052均能够抑制YY1的表达，从而抑制肿瘤生长或增强治疗的敏感性[12]，但并未见在血管病变如动脉粥样硬化中的报道。

1.4 ATF3

活化转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/cAMP反应元素结合(CREB)蛋白家族的成员[13]。ATF3在静息的内皮细胞中表达水平较低，但可以受到多种刺激如细胞因子和趋化因子的诱导。适当的ATF3活性对细胞的正常生理非常重要，而ATF3功能障碍与各种病理生理反应相关，如炎性反应、凋亡、氧化应激和内质网应激，以及疾病包括心血管疾病[14]。有研究[15]显示，在体外平行板流动腔系统中对人冠脉内皮细胞施加振荡型剪切力[(0±5)dyn/cm2]和层流型剪切力(15 dyn/cm2)并不能影响ATF3的表达，但在模拟血管斑块狭窄处的高剪切力(75 dyn/cm2)作用下，ATF3的表达会明显增加。对冠心病患者的血管尸检发现，ATF3的表达与动脉粥样硬化斑块的进展和稳定性具有相关性，表现在ATF3表达与内膜、坏死灶厚度负相关，与纤维帽厚度正相关，与炎性反应因子、VCAM1、MMP-9负相关，且ATF3可能通过调节动脉粥样硬化斑块的炎性反应来影响动脉粥样硬化斑块的结构稳定性[16]。因此在斑块发生早期对ATF3进行干预可能会是防治动脉粥样硬化的有效措施。

有研究显示PP2(SRC通路抑制剂)、KN93(CaMK Ⅱ通路抑制剂)和IWP-2(Wnt/β-catenin通路抑制剂)可以降低ATF3的转录水平，并减少肿瘤细胞的生长[17]。但在心血管系统中，在不同的转录调控过程中，ATF3可能在抑制因子和激活因子之间转换[18-19]。此外，对ATF3本身的调控是复杂的，因为ATF3的活性不仅受到表达的调节，还受到翻译后修饰的调节，如泛素化和SUMO化[20]。因此还需要更多的研究去确认ATF3在动脉粥样硬化进展中的角色。

2 转录辅因子调控通路及靶向治疗

2.1 YAP/TAZ

YAP和TAZ是转录协同调节因子，能够响应多种机械信号(剪切力、硬度、拉伸、形状)来调节增殖和分化。YAP/TAZ受到上游Hippo信号通路的抑制，MST1/2激酶磷酸化并激活LATS1/2激酶，使YAP/TAZ磷酸化。关键丝氨酸残基的磷酸化导致YAP/TAZ滞留在细胞质中并降解。相反，去磷酸化的YAP和TAZ转运到细胞核，结合TEAD因子，诱导下游基因表达[21]。研究表明，扰流增强了YAP的去磷酸化激活，并且与内皮细胞的炎性反应激活有关[22-24]。在脐静脉内皮细胞中，YAP 第127位丝氨酸(YAP S127)在层流型剪切力(12 dyn/cm2)作用下磷酸化增加，在扰流剪切力[(0.5±6)dyn/cm2]作用下磷酸化减少，表明扰流能够激活YAP，使YAP/TAZ靶基因表达增加。在小鼠体内动脉粥样硬化易发区也观察到核YAP升高和p-YAP降低。在高脂血症小鼠中，全身YAP/TAZ缺乏(通过morpholino寡核苷酸)[24]或内皮细胞特异性YAP敲除(通过CRISPR/Cas9技术)[23]可降低ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块形成。相比之下，在内皮细胞YAP或全身TAZ或YAP/TAZ的结构性活性突变体过表达的ApoE-/-小鼠中，可促进动脉粥样硬化[23]。这些在小鼠中进行的一系列功能激活和缺失的研究证明，YAP/TAZ/TEAD是预防动脉粥样硬化的一个有前景的治疗靶点。

维替泊芬(一种光动力治疗中的光敏剂)是首个通过干扰YAP和TEAD相互作用而抑制YAP/TEAD的化学抑制剂。在以西式饮食喂养的ApoE-/-小鼠中，维替泊芬同时伴有光激活，可延缓动脉粥样硬化和巨噬细胞凋亡[25]。他汀类药物辛伐他汀也可抑制YAP/TAZ的激活，促进他汀类药物的动脉粥样硬化保护作用[23]。洛伐他汀通过抑制YAP和TAZ来抑制血管紧张素II诱导的心血管纤维化[26]。藤黄酸(gambogic acid, GA)最近被发现是YAP/TAZ的抑制剂，它通过阻止内皮细胞的增殖、迁移、发芽和管状形成来抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管生成过程[27]。甲氨蝶呤抗炎治疗通过抑制AMPK活性抑制了扰流诱导的内皮细胞中YAP/TAZ的激活,显著降低了内皮细胞中的促炎因子分泌和单核细胞粘附[28]。这些临床前研究结果表明，YAP/TAZ/TEAD抑制是治疗内皮功能障碍和动脉粥样硬化的一种有前途的策略。

2.2 Wnt/β-catenin

典型的Wnt/β-catenin通路在发育、组织稳态和癌症等疾病中发挥着多种关键的作用。β-连环蛋白(β-catenin)在细胞骨架连接和转录辅助因子中扮演着双重角色。在未受刺激的细胞中，胞质β-catenin通过多组分“破坏复合物”迅速降解。而各种刺激能通过Wnt配体结合其跨膜受体Frizzled(Fz)和脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)，抑制破坏复合物并稳定β-catenin，β-catenin因此在细胞核中积累，并与T细胞因子/淋巴增强因子结合因子-1(TCF/Lef-1)转录因子结合，以驱动靶基因表达[29]。在心血管系统中，Wnt/β-catenin通路在发育过程中发挥多种重要的作用，包括内皮细胞分化、心脏瓣膜形态形成中的内皮-间质转化、血脑屏障的建立和血管生成[30-31]。人主动脉内皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路可被振荡剪切力[(0±3)dyn/cm2]激活[32]。在ApoE-/-小鼠的主动脉弓内弯处能观察到β-catenin定位细胞核中，而在外侧和胸主动脉长直段则没有明显的β-catenin核定位[33]。这些结果表明针对Wnt/β-catenin信号通路进行干预可能会是防治动脉粥样硬化的有效措施。

通过靶向Wnt的分泌或β-连环蛋白破坏复合物的转换，可以对心血管系统疾病有一定的治疗效果。例如，GNF-6231是Wnt棕榈酰化的抑制剂，它能抑制典型和非典型Wnt配体的分泌，在心肌梗死模型中，瞬时给予GNF-6231限制了纤维化心肌损伤并促进恢复[34]。同样，端锚聚合酶拮抗剂XAV939可以降低Wnt通路中β-连环蛋白的表达，增加Axin水平，减少典型Wnt信号通路和机械损伤诱导的新生内膜形成[35]。这些数据表明，一些正在开发的用于癌症治疗的新型靶向Wnt/β-catenin通路的小分子可能被重新用于某些心血管疾病。

2.3 APEX1

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APEX1)是一种具有无嘌呤/无嘧啶位点内切酶活性的DNA修复酶，在DNA碱基切除修复途径中发挥重要的作用，它还具有氧化还原调节的功能，能够调控多种转录因子例如NF-κB、AP-1、HIF1α、p53的DNA结合活性和转录活性[36]。研究[37]表明，细胞核中的APEX1具有稳定DNA并且转录激活的作用，而细胞质中的APEX1则具有抑制ROS产生和抗炎、抗凋亡的作用。本课题组最近的研究[38]发现，受层流(或脉冲型剪切力)作用的内皮细胞中APEX1多分布于细胞质中，而受扰流(或振荡型剪切力)作用的APEX1向细胞核中转位，提示APEX1 是一种剪切力信号敏感分子。敲低和抑制内皮细胞内APEX1的活性能够抑制细胞促炎因子的表达。利用内皮特异性APEX1敲除小鼠合并AAV8-PCSK9病毒注射造就高脂血症、ApoE-/-小鼠叠加颈动脉APEX1病毒孵育与部分结扎诱导血流扰动，明确了内皮细胞APEX1的促炎和促动脉粥样硬化发生作用。这项研究证明，APEX1是预防和治疗动脉粥样硬化的一个有前景的治疗靶点。

鉴于目前APE1/Ref-1在癌症发病机制和DNA相互作用药物耐药中发挥重要作用，因此已有研究关注APEX1小分子抑制剂的鉴定[39]。APEX1核酸内切酶活性的抑制剂如甲氧基胺、甲硫恩酮、羟胺硫蒽酮等具有比较强的碱基切除修复的抑制能力，能够增强对肿瘤杀伤以及肿瘤的放化疗敏感性[40]。而APEX1氧化还原功能的抑制，具有较小的细胞毒性和较强的抑制转录因子的活性，成为了新型肿瘤防治药物的开发重点。一些天然产物例如白藜芦醇、姜黄素、大豆黄素、丹参酮IIA等被发现均能抑制APEX1与NF-κB通路，从而抑制炎性反应与肿瘤生长[40]。APEX1氧化还原特异性抑制剂E3330可以有效杀伤肿瘤细胞而对正常细胞没有生长抑制作用，但仍具有一定的细胞毒性[41]。本课题组基于网络药理学方法预测出新的且低细胞毒性的APEX1氧化还原抑制剂牡荆素，并将其应用在心血管系统疾病中[38]。通过细胞热转移分析(CETSA)实验[42]验证了牡荆素在内皮细胞中与APEX1直接相互结合并改变APEX1的拓扑结构，改变其变性温度。通过表面等离子体共振(SPR)实验证明了牡荆素相较于E3330能够更多地与APEX1相互结合。发现牡荆素能够通过抑制APEX1的核转位而保护血管内皮细胞免受体外振荡型剪切力和TNFα刺激引起的炎性反应，并且抑制体内病理性扰流引起的小鼠新生内膜形成和ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成。这些研究结果提示，牡荆素以及一些正在开发的用于癌症治疗的APEX1抑制剂可能是治疗内皮功能障碍和动脉粥样硬化的有前途的策略。

3 总结和展望

流体剪切力作用于血管内皮细胞后，可通过机械力感受器将机械刺激转化为生化信号，促进或抑制内皮细胞的炎性反应。过去几十年间，已有受到流体剪切力调控的转录因子、转录辅助因子及其相关信号通路被报道。本文总结了近年来部分与内皮细胞炎性反应相关的转录因子信号通路，包括层流诱导的动脉保护性转录因子KLF2/4，扰流诱导的促动脉粥样硬化的转录因子如NF-κB，新近发现可能在血管生理中具有重要作用的YY1和ATF3，转录辅因子如YAP/TAZ、Wnt/β-catenin和APEX1调控通路，以及针对这些转录因子通路的抗动脉粥样硬化治疗方案。

内皮细胞从感知机械力、传导力学信号到产生效应的过程中有多种转录因子信号通路的参与。各个信号通路之间并不是完全独立。例如NF-κB和KLF2信号在内皮细胞中相互起拮抗作用，NF-κB通过抑制MEF2的转录活性来降低KLF2的表达，而KLF2和KLF4反过来能够抑制NF-κB的功能和黏附分子的表达[43]。内皮细胞功能的多样性反映在剪切力诱导的信号传导机制的多样性上，但多种机制对特定类型的机械力刺激可能是协调一致的。因此整合内皮细胞中受剪切力调控的多个信号通路，并找出关键的转录因子，以此为靶点进行药物筛选和开发，可能是靶向治疗心血管疾病的有效方式。