CircRNAs在阿尔兹海默病中的研究进展

刘文胜 综述 柳湘洁审校

华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年病科，湖北 武汉 430077

阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)是一种与衰老相关的最常见的神经退行性疾病，目前全世界范围内有超过4 000万人患此病[1-2]，其已成为一个重大的公共卫生问题，给个人、社会和经济造成沉重负担[3]。1907 年，德国精神科医生和神经病理学家ALOIS ALZHEIMER博士首次描述了阿尔兹海默病[4]。根据2015年世界卫生组织(WHO)的研究，阿尔兹海默病占老年痴呆症病例的60%～70%，到2050 年其发病率估计增加两倍[5-6]。目前普遍认为，淀粉样前体蛋白(APP)裂解的变化、APP片段和β-淀粉样蛋白(Aβ)的产生和沉积是导致阿尔兹海默病的可能原因，被称为淀粉样蛋白级联假说[4]。Aβ是阿尔兹海默病最主要的病理学特征和诊断指标，可以用来与其他伴有痴呆症状的神经退行性疾病区分[7]。此外，tau磷酸化学说、胆碱能学说、胰岛素假说、氧化应激学说等也被认为是阿尔兹海默病可能的致病机制[8-9]。尽管患有AD的患者人数在不断增长，但在美国目前仅批准了五种方案来治疗AD的认知症状，其中最近的一项(美金刚)已于十多年前获得批准[10]。这些药物包括三种胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐，加兰他敏和卡巴拉汀)和一种N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚)[11]。在过去的15年中，很多科研机构在研发治疗AD的药物，但大多数都失败了。目前，大多数已被确诊为AD的患者仅以被动接受药物治疗为主，且治疗效果不佳。因此，寻找新型可延缓或逆转AD的药物仍是目前的重中之重。

circRNAs 是一类内源性的环状非编码RNA 分子。CircRNAs 以前被认为是转录后加工过程中错误剪接事件衍生的产物，并且丰度低，功能潜力小[12]。但是，最近有越来越多的证据表明，circRNAs 在整个真核细胞中分布广泛，种类繁多，它们具有多种生物学功能，并且在各种疾病(例如神经退行性疾病和癌症)中发挥着潜在的重要作用[13-15]。CircRNAs已在许多生物学领域得到广泛认可和重视。先进的研究表明，大脑中有成千上万的circRNAs[16-17]。随着深度测序技术的发展，临床已经鉴定出其他新颖的circRNAs，并显示与脑部疾病有关。最近的研究表明，circRNAs 在神经退行性疾病中可能起重要作用，包括阿尔兹海默病[18-20]。本篇综述将讨论circRNA的分类和功能以及circRNAs在阿尔兹海默病中的研究进展。

1 circRNA的分类

大多数circRNAs 是通过反向剪接由前体mRNA(pre-mRNA)形成的。随着测序技术的发展，已经发现并鉴定了几种类型的circRNAs。根据其特征可以分为四个亚型，即外显子型circRNAs(ecircRNA)、环状内含子型circRNAs (ciRNA)、外显子-内含子型circRNAs(EIciRNA)和tRNA内含子型circRNA(tricRNA)。

1.1 EcircRNA EcircRNA主要位于细胞质中，主要来源于单个或多个外显子，通过转录产物的反向拼接形成的。5'剪接位点(剪接供体位点)与3'剪接位点(剪接受体位点)相连，产生包含外显子和内含子的套索结构[21]。套索状结构中的内含子被去除后外显子通过和磷酸二酯键连接形成ecircRNA 分子[22]。另外，内含子中的Alu重复序列可以彼此相互作用，以促进反向剪接[27]。

1.2 CiRNA 在形成CiRNA 的过程中，内含子从前mRNA分子中切除，并通过两个末端之间的独特2'-5'连接进行进一步连接，然后修剪尾部形成CiRNA。CiRNA 主要存在于细胞核中，仅包含内含子。其加工取决于共有基序，这些基序包含靠近5'剪接位点的富含7-nt GU 的元素和靠近分支点位点的富含11-nt C的元素[23]。

1.3 EIciRNA 与EcircRNA(仅包含外显子)不同，EIciRNA 既包含外显子又包含内含子。一个外显子的5'下游位点(剪接供体位点)通过5'-3'磷酸二酯键连接到另一个外显子的3'上游位点(剪接受体位点)，并受套索驱动的环化作用。在反向剪接过程中，内含子被保留在外显子之间[24-25]。

1.4 TricRNA TricRNA 通 过pre-tRNA 剪 接 形成。通过tRNA 剪接酶将内含子从前tRNA 分子中去除。随后，在内含子的末端形成具有3'-5'磷酸二酯键的闭环结构，产生tricRNA[26]。

2 CircRNAs的功能

2.1 CircRNAs调节线性RNA的转录 CircRNAs可以影响线性RNA的剪接，并在选择性剪接和转录中发挥关键作用。外显子是CircRNAs 的主要来源，而CircRNAs 的合成过程与线性RNA 的典型剪接竞争，因为外显子对于通过典型剪接形成的线性mRNA 也是必不可少的[27]。因此，当CircRNA和线性mRNA的形成都需要相同的外显子时，这两个过程将相互竞争。CircRNAs 还可以与细胞质中的RNA 结合蛋白(RBPs)或与RNA 相关的蛋白相互作用，形成RNA-蛋白复合物，影响基因转录或蛋白质翻译。CircRNA-RBP 复合体可以调控靶基因的转录和剪接，改变线性mRNA的剪接模式和mRNA稳定性，并启动其翻译。此外，CircRNAs 可以与RBPs 相互作用以募集miRNA，从而影响下游靶mRNA的翻译[27]。由内含子形成的CircRNAs，例如CiRNA 和EIciRNA，可以调节其亲本基因的表达。在细胞核中，发现CircRNAs 通过与U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ相互作用来调节转录[28-29]。EIciRNA 与U1 snRNPs 相互作用形成EIciRNA-U1 snRNPs复合物，并在其亲本基因启动子处与RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以增强这些基因的表达[30]。

2.2 CircRNAs充当miRNA的“海绵” CircRNAs可以作为miRNA 的海绵，抑制miRNA 介导的mRNA表达[31]。作为竞争性内源RNA，CircRNAs 可通过与miRNA 反应元件结合而与miRNAs 竞争。CircRNAs包含一个或多个miRNA 结合位点，从而减少了miRNA介导的基因抑制表达，进而调控下游靶基因表达。

2.3 CircRNAs充当蛋白质翻译的模板 大多数CircRNAs 都是由编码片段产生的。因此，一些CircRNAs 可能具有编码蛋白质的潜力。5'7-甲基鸟苷帽结构和3'poly(A)尾部是正常的线性mRNA 翻译所必需的。然而，由于circRNAs 既缺少帽盖又没有poly(A)尾巴，因此它们似乎没有合适的结构来支持翻译起始。最近的研究表明，CircRNAs 也可以翻译成蛋白质或肽。为了将CircRNA翻译成为功能性蛋白，它必须包含一个开放阅读框和一个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是内源性CircRNAs 中的特殊核苷酸序列，可独立于5'帽结构启动蛋白质翻译[32]。一旦在其IRES处启动翻译，CircRNA就会充当蛋白质翻译的模板。

2.4 CircRNAs与蛋白质相互作用 CircRNAs可以与不同的蛋白质相互作用形成特定的CircRNA-蛋白质复合物(circRNPs)，随后会影响相关蛋白质的作用方式。例如，circMbl可与甘露糖结合凝集素(MBL)相互作用，并充当MBL 和circMbl 产生的负反馈调节剂[27,33]。MBL和circMbl由相同的基因位点产生，并且在它们的产生之间存在负调节反馈。当以过量浓度存在时，MBL结合至MBL pre-mRNA并导致其反向剪接形成circMbl。然而，当MBL蛋白与circMbl结合而浓度降低时，没有足够的MBL 与circMbl 相互作用。此时，CircMbl的产生就会减少。

3 CircRNAs在AD中的作用

长期以来，AD患者大脑中β淀粉样蛋白(Aβ)的过度积累一直被认为是AD病理的最重要原因之一[34-35]。AD患者大脑中Aβ的异常水平导致斑块的形成，并进一步导致由小胶质细胞激活介导的神经元炎症反应，从而促进AD进展[36]。此外，越来越多的证据表明，氧化应激和功能障碍的自噬在Aβ的产生中起着至关重要的作用，并可能加速AD 的发展[37-38]。目前研究发现，一些CircRNAs 在神经炎症、氧化应激和自噬以及Aβ的产生和降解中发挥重要的调节作用。

3.1 CircRNAs与神经炎症 神经炎症通常被认为是由损伤或淀粉样斑块形成引起的神经胶质活化的结果，进一步导致脑功能恶化，这与AD 风险增加有关[39]。CircRNAs 已被报道参与神经炎症的调节。研究已证实，CircRNA_0000950在AD的细胞凋亡、神经突生长和神经炎症中起重要作用。此外，YANG等[40]证明cir cRNA_0000950 充当miR-103 海绵来减少miR-103 的表达，进一步提高细胞AD 模型中前列腺素氧化环化酶2 的水平。尽管circRNA_0000950的表达不受神经元细胞中Aβ1-42诱导的影响，但是circRNA_0000950 的过表达促进神经元细胞凋亡，抑制神经突生长并提高炎性细胞因子水平，而circRNA_0000950 的敲除后出现相反作用。因此circRNA_0000950的敲除是治疗AD的一种潜在治疗手段。

3.2 CircRNAs与氧化应激 氧化应激已被认为是导致衰老和AD进展的一个重要因素[38]。活性氧的增加会促进Aβ蛋白前体的表达和加工，导致Aβ积累并激活大脑中各种信号通路，从而进一步促进AD 的发 展[41]。HUANG 等[42]研 究 表 明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表达的调节与AD氧化应激损伤的预防有关。他们发现SAMP8(快速老化动物模型)小鼠海马组织中mmu_circRNA_013636 增加，mmu_circRNA_012180 减少；然而，三七总皂苷(PNS)的治疗逆转了AD小鼠大脑中这些CircRNAs的表达变化。进一步的功能分析表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 参与代谢、神经营养因子和糖酵解以及磷脂酰肌醇信号通路，这些已被证明有助于AD 的发病机理。上述结果表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表 达的调节可能通过抗氧化应激机制参与PNS对AD的治疗作用，这表明这些CircRNAs是AD治疗药物开发的潜在靶标。

3.3 CircRNAs与自噬 自噬是长寿蛋白质和细胞器的主要细胞降解途径。自噬体的积累是AD 的早期神经病理学特征，直接影响Aβ代谢。研究表明，特定CircRNAs 的表达与AD 中的自噬密切相关。例如，最近有报道称CircNF1-419 与AD 中的自噬密切相关[43]。老年SAMP8 (快速老化动物模型)小鼠中CircNF1-441的过表达会增强自噬，进一步降低tau 蛋白、p-tau 蛋白、Aβ1-42蛋白和载脂蛋白E(APOE)的水平，并影响与衰老相关的调节子p21、p35/25 和p16 的表达。 此外，CHEN 等[43]证实circNF1-419 通过与动力蛋白-1 (Dynamin-1)和衔接蛋白2B1(AP2B1)相互作用来调节自噬。CircNF1-441 结合Dynamin-1 和AP2B1影响它们的mRNA剪切、稳定和翻译。这些结果表明，circNF1-419 可通过与Dynamin-1 和AP2B1相互作用增强自噬，从而延迟AD 的发展。其他研究表明，CircRNAs可能与自噬小体组装或囊泡运输介导的途径有关。HUANG 等[44]的研究发现10 个月大的SAMP8 (快速老化动物模型)小鼠的mmu_circRNA_017963 水平与对照组小鼠相比明显降低，表明该CircRNA 与AD 发病机理有关。进一步的分析表明，mmu_circRNA_ 017963 可 能与mmu_miR_7033-3p 结合，并且它可能参与自噬小体组装、胞吐作用和突触小泡循环的生物学过程，这些已被证明与AD 的发病机理有关。

3.4 CircRNAs与Aβ产生 AD病理学的一个主要特征是由聚集的淀粉样蛋白Aβ组成的斑块的形成。减少Aβ的产生一直是近年来AD 实验研究的主要目标[34-45]。一些CircRNAs 已被鉴定出直接或间接参与Aβ生成的调节，表明它们在AD病理中起着重要的作用。例如，miR-7的circRNA海绵(ciRS-7)以前被认为是miR-7 的内源性海绵，最近有报道称它在AD 的发病机制中起着至关重要的作用。先前的研究表明，ciRS-7 在人脑中富集，但在AD 患者的脑中表达下调。ZHAO等[46]发现，ciRS-7改变了泛素蛋白连接酶A(UBE2A)的表达，这对于清除AD 中的Aβ是至关重要。在散发性AD 中，ciRS-7 下调并且miR-7 的水平升高，导致UBE2A 表达降低[39]。UBE2A 在泛素26S蛋白酶体系统中起着中央效应器的作用，通过蛋白水解促进Aβ的清除。然而，在散发性AD 脑中，UBE2A已耗尽，这进一步诱导了淀粉样蛋白Aβ的积累和老年斑的沉积。最近，SHI等[47]研究表明，ciRS-7在调节β-分泌酶(BACE1)和APP蛋白水平中也起着至关重要的作用。其中，BACE1 已被确定为AD病理生理学中产生Aβ肽的关键酶。BACE1 对APP 的裂解诱导Aβ肽释放并引发Aβ斑块形成[48]。SHI 等[47]发现ciRS-7 不影响APP 和BACE1 的mRNA 水平，而是降低APP 和BACE1的蛋白水平。他们的进一步研究表明，在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中ciRS-7 过表达会上调泛素羧基末端水解酶L1 (UCHL1)的mRNA 和蛋白水平，从而通过蛋白酶体和溶酶体途径，加速APP 和BACE1 的降解，并减少Aβ的产生[47]。因此，表明ciRS-7具有潜在的神经保护作用。

LU 等[49]研究发现，circRNA HDAC9 也与Aβ生成的调节有关。CircHDAC9 在轻度认知障碍(MCI)和AD 患者的血清中显著低于其他正常的个体，并且在AD 的小鼠和细胞模型中也降低。此外，研究表明cir cHDAC9充当miR-138海绵，可显著降低miR-138的水平，同时增加沉默信息调节因子1(sirtuin1，Sirt1)的蛋白表达。先前有研究已经证实，Sirt1在减少Aβ的积累和减轻线粒体功能障碍方面发挥着重要的作用[50]。LU 等[49]发现，在体外实验中CircHDAC9表达可以减少过量Aβ肽的产生，这表明cir cHDAC9可能是AD的治疗靶标。

ZHANG 等[46]研究表明，circRNA KIAA1586 可以作为竞争性内源RNA 发挥功能，吸附miR-29b、miR-101 和miR-15a，这可能与AD 的病理过程有关。 PEREIRA 等[51]研究表明，在AD 细胞模型中，miR-29b 的过表达抑制了BACE1 的mRNA 和蛋白表达，并降低了Aβ42的水平。LONG等[52]证实了miR-101可以与APP的3'-UTR结合以降低AD中APP的水平。HEBERT 等[53]发现散发性AD 患者的表达miR-15a 的大脑皮质发生了显著变化，并预测miR-15a 可以结合并调节BACE1 和APP。这些结果表明，circRNA KIAA1586是治疗AD潜在的靶标。

4 结语

CircRNAs具有高度稳定性，能够稳定地存在于血浆和脑脊液中，因此具有诊断神经系统疾病的巨大潜力。最近的一项研究表明，CircRNAs 表达水平与AD的神经病理学和临床严重评估密切相关[18]。DUBE等[18]实验已经表明，CircRNAs 的表达在AD患者实质性症状发作之前已经发生了改变，并且它们在血浆中稳定存在和在外泌体中富集。这一发现表明，CircRNAs 可以作为症状前和症状性AD 以及潜在的其他神经退行性疾病的外周生物标志物。

CircRNA与特定的miRNA共享结合位点，这使它们能够充当miRNA海绵并抑制这些miRNA的调节功能。同时，CircRNAs 在Aβ的产生和代谢、氧化应激、自噬和神经炎性途径中起重要作用。此外，一些CircRNA可用作具有AD诊断潜在价值的新型生物标志物，如CircRNA_0000950 、mmu_circRNA_013636、mmu_circRNA_012180、CircNF1-419 和ciRS-7等。

如上所述，CircRNAs 在AD 中起关键作用，并且可能具有治疗AD 的潜力。更多的CircRNAs 的表达特征和功能应在未来的研究中得以探究，以开发AD的新型治疗靶标和生物标志物。