促红细胞生成素的神经保护作用研究进展

李兴玉 综述 曹云涛 审校

遵义医科大学附属医院新生儿科，贵州 遵义 563003

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)于1971 年从贫血羊血浆中发现并提纯[1]，其后利用基因重组技术克隆出重组人促红细胞生成素(recombinant human erythrpoietin，rhEPO)[2]；EPO可促进红系祖细胞的分化与成熟、促进红细胞生成，最先应用于治疗肾性贫血；儿科领域中EPO 已用于治疗早产儿贫血。近来发现EPO除有促进红细胞生成作用外，还有广泛的生物学活性，特别在神经系统的保护作用越来越受到重视。本文就EPO 及其受体的分布、神经保护机制，从分子机制、动物实验和临床试验等方面的最新研究进行综述，以便更深入地了解EPO神经保护作用。

1 EPO产生及分布

促红细胞生成素(EPO)是一种分子量为30.4 kDa的糖蛋白，胚胎时期主要由胎儿肝脏产生，成年后EPO主要由肾脏血管周围间质成纤维细胞产生，非造血组织如肝脏、大脑、视网膜也产生EPO，在除肾脏以外的器官中的表达约占整个生物体总产量的15%～20%[3]。EPO 通过刺激骨髓中红细胞前体细胞上的EPO 受体(EPOR)来诱导红细胞生成，从而增加其存活、增殖和分化，最终增强携氧能力。EPO 受体(EPOR)分布并不局限于红细胞，在心脏、大脑、视网膜、胰腺和肾脏等许多器官表达，在这些器官中介导EPO发挥生物学作用。当暴露于缺氧、创伤和其他刺激时，EPO 及其受体的表达上调，通过多种作用机制起重要的神经保护作用[4]。

2 EPO的神经保护机制

2.1 促进神经再生、损伤修复和正常发育 在脑和血管系统的发育中EPO 已被证明具有促进和刺激神经发生的相关功能。通过对小鼠腹腔内注射重组人促红细胞生成素(rhEPO)，模拟内源性神经元EPO/EPOR信号传导可以增加锥体神经元的树突棘密度，增加成熟的海马锥体神经元的数量[5-6]。越来越多的研究认为，小胶质细胞可以表现出不同的表型，并能对特定的微环境做出不同的反应[7]。在损伤部位同时存在M1 和M2 两种小胶质细胞表型，M1 小胶质细胞增加促炎介质的分泌，从而损害轴突的再生，相反M2 小胶质细胞可介导神经保护功能并促进神经再生。EPO 处理后，在脑缺血后同侧皮质中M1 标志物CD16 和CD11b 的蛋白表达水平显著降低，而M2 标志物CD206 的表达显著上升，EPO 可以阻止M2 向M1 的转变并保持M2 小胶质细胞表型，修复脑白质完整性[8-9]。根据最近的一些研究显示，Janus 激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路参与了中枢神经系统损伤后小胶质细胞的转化[10-11]。非红细胞生成突变体促红细胞生成素(mutant erythropoietin，MEPO)通过JAK2/STAT3 和C/EBPβ信号通路促进小胶质细胞向有益的M2 表型转化，从而促进了少突胶质细胞的形成[12]。MEPO可以刺激脑缺血小鼠恢复期的神经再生和血管生成，抑制过度的胶质形成，这表明MEPO对非小胶质细胞(包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)具有潜在的作用[13]。EPO通过激活JAK2-PI3K-NF-κB信号通路进而上调神经元中生长和分化因子10(Growth and differentiation factor 10，GDF10)的水平，促进轴突形成，并呈剂量依赖性[14]。促红细胞生成素可减轻树突棘的损伤和海马区的胆碱能功能障碍，通过刺激JAK2/STAT5/PI3K/Akt 信号通路抑制海马GSK-3β的过度激活。此外，MA等[15]发现shRNA 对EPO 受体(EPO-R)的基因敲除阻断了EPO对血管性痴呆(vascular dementia，VD)的神经保护作用，推测促红细胞生成素治疗能够通过刺激促红细胞生成素受体来修复血管性痴呆的记忆损害。

2.2 抗氧化活性，调节免疫 研究证实EPO的表达受缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1，HIF1)的调控。HIF1α是细胞对缺氧和氧化应激适应性反应的转录激活因子和主要调节因子，介导过多的适应性反应，包括谷氨酸和丙酮酸脱氢酶激酶1 促进糖酵解而抑制线粒体氧化磷酸化，血红素氧合酶-1 (Heme oxygenase-1，HO1)和核因子样2 (NRF2)用于减轻氧化应激，减轻脑损伤[16]。脑内促炎症细胞因子的上调、局部小胶质细胞和系统性淋巴细胞(systemic lymphocytes)的激活以及白细胞的浸润是缺血性脑损伤的重要原因，调节性T淋巴细胞(regulatory T cells)可以拮抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-δ(IFN-δ)的产生，而TNF-α和IFN-δ的产生导致迟发性炎性脑损伤[17]。免疫系统也参与缺血再灌注损伤，组织修复和再生的证据表明EPO 的免疫调节作用也可能与其组织保护作用有关[18]。JM4是一种源自人类促红细胞生成素的第一环的19'mer 环状肽。该肽具有有益的免疫调节和组织保护作用，同时没有促红细胞生成素所致的血栓栓塞等不良副作用。JM4 进行长期治疗可延迟PS19 小鼠(一种tauopathy 的动物模型)的神经功能障碍的发作并延长其寿命。长期JM4 治疗可减少PS19小鼠大脑中的IBA-1和MHC II诱导以及补体成分C3升高(神经炎症)，从而减少神经元丢失(神经变性)和小胶质细胞激活。通过慢性JM4 治疗降低了包括IL1β和TNF-α在内的促炎细胞因子的表达[19]。

2.3 防止细胞凋亡，减轻炎症 Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡成员(如Bax)和抗凋亡成员(如Bcl-2)在细胞凋亡的调控中起着关键作用。已知裂解的Caspase-3在Bax/Bcl-2的下游起作用，在凋亡的执行中也起着关键作用。通过体外氧-葡萄糖剥夺(OGD)进行细胞培养，模拟了体外HIE的状况[20]。OGD处理可增加Bax 的蛋白表达并切割Caspase-3。相反，OGD 后Bcl-2 的蛋白表达以及Bcl-2/Bax 比值降低。与OGD处理相比，EPO 处理可逆转Bcl-2、Bax 和裂解的Caspase 3的蛋白质表达，以及Bcl-2/Bax比[21]。OGD后细胞凋亡率增加[22]，越来越多的证据表明EPO可以保护神经元细胞免受OGD 诱导的细胞凋亡[23-26]。在OGD后源自低温星形胶质细胞的液体培养基ACM的存在下，裂解的Caspase 3 和TdT 介导的dUTP 缺口末端标记阳性的凋亡神经元的数量要比OGD后从常温星形胶质细胞存在的ACM 的数量要少。OGD 后，使用抗EPO 中和抗体阻断EPO 信号传导会减弱源自低温星形胶质细胞的ACM 的抗凋亡作用[27]。中枢神经系统损伤的严重程度与小胶质细胞激活和促炎细胞因子产生的牢固性密切相关。小胶质细胞在急性或慢性神经炎症反应中起着重要介质的作用，过度活化会加剧炎症反应并介导细胞变性，导致神经元死亡。最近的一项研究报道，EPO预处理可以减弱脂多糖诱导的小胶质细胞的激活，包括体内的形态学变化、体外的吞噬作用以及体内和体外炎性细胞因子的产生[28]。EPO可通过多种机制减轻神经炎症，包括减少小胶质细胞活性以及iNOS 和COX-2 的表达。另外，还调节了磷酸化AKT、mTOR和凋亡指示剂(如BAX，BCL-2和裂解的Caspase-3)的表达。EPO 抑制AKT-mTOR途径，以减轻烧伤诱导的运动神经元凋亡和小胶质细胞活化[29]。缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)损伤会严重损害大鼠的神经行为表现，包括感觉运动、自发运动和认知能力。HI 损伤还会在大鼠的白质、纹状体、皮质和海马区导致脑部炎症和神经元死亡。rhEPO预处理(对幼鼠进行HI 并腹膜内注射前1 h 加入rhEPO)和后处理(低氧暴露后1 h，对幼鼠进行HI注射rhEPO)均显著改善了神经行为表现，并防止了HI诱导的神经元死亡，小胶质细胞活化(OX42+)以及成熟少突胶质细胞(APC-CC1+)和海马神经元(Nissl+)的丢失。Fluoro-Jade B是一种聚阴离子荧光素衍生物，能敏感且特异性地结合退化神经元，OX42 是小鼠小胶质细胞特异性标志CD11b。与用rhEPO 进行后处理相比，用rhEPO进行预处理提供了更好的抗炎和抗凋亡作用，通过减少OX42染色(小胶质细胞)和Jade B染色(退化的神经元)来表明[30]。

2.4 抗神经毒性 谷氨酸转运蛋白1(GLT-1)和谷氨酸天冬氨酸转运蛋白(GLAST)是阳离子依赖性谷氨酸转运蛋白，不仅将谷氨酸转运到神经胶质细胞中，而且还可以在细胞内和细胞外环境中维持适当的谷氨酸梯度。在脑缺血缺氧期间，兴奋性神经递质谷氨酸的释放会导致脑损伤。来自动物和临床实验的大量证据表明，高浓度的细胞外谷氨酸与神经损伤密切相关。细胞外谷氨酸诱导的过度神经毒性可导致神经元死亡[31]。目前的结果表明，脑缺血再灌注降低了GLT-1 和GLAST 的mRNA 和蛋白水平，而EPO 预处理显著提高了缺血再灌注后的这些水平。这表明由于EPO 预处理而导致的针对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能部分归因于GLT-1和/或GLAST表达的上调[32]。在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)中，β淀粉样蛋白(amyloid beta，Aβ)产生和清除平衡障碍导致脑内Aβ过度沉积是AD 主要的发病原因。Aβ淀粉样肽的积累与细胞凋亡直接相关，AD中的Aβ肽负责离子稳态的丢失，因为它能够穿透细胞膜，形成一个孔，允许阳离子，尤其是钙离子大量进入，导致细胞凋亡和细胞内ATP 失衡[33]。促红细胞生成素变体(EPOL)具有不同的糖基化模式，其特征是中性的、双触角的和α-唾液酸化的结构，保留了神经保护作用，但没有造血活性。EPOL 对Aβ诱导的毒性具有神经保护作用，其机制涉及EPOR、活性氧的减少和星形胶质细胞增生的减少。此外，EPOL 治疗还可以减少由于长期暴露于Aβ而导致的钙超载。EPOL 还对慢性Aβ诱导的氧化应激具有神经保护作用，其浓度比EPO低10倍[34]，促红细胞生成素衍生物有望成为各种神经疾病的治疗剂。

3 EPO的神经保护作用

3.1 体外细胞实验 GYETVAI 等[35]证实通过培养野生型中枢神经胶质4(CG4)细胞，促红细胞生成素可能通过诱导胰岛素样生长因子和增加脂质代谢来增加少突胶质细胞的髓鞘再形成。WENKER 等[36]通过神经元细胞(SH-SY5Y)在活化的小胶质细胞EOC-2 或巨噬细胞的条件培养基中培养后发生了较多的凋亡，而EPO通过激活EPO/EPOR受体来消除这一效应，表明EPO增加了神经元对促炎剂造成的损伤的抵抗力。

3.2 体外动物实验 LIU 等[37]诱发的小鼠早产儿宫内感染可导致氨基酸受体NMDA过度活化，然后介导氨基酸的兴奋性毒性，从而导致神经元凋亡。用重组人促红细胞生成素治疗后，可以通过抑制氨基酸的兴奋性毒性来抑制NMDA 过度活化，促进脑内源性神经干细胞的增殖和分化，对宫内感染引起的早产小鼠脑损伤具有一定的治疗作用。GOVINDAPPA 等[38]在严重坐骨神经挤压伤小鼠模型(SSCI)中证实：在轻度至中度坐骨神经挤压伤后，单剂量促红细胞生成素治疗可促进功能恢复并增强神经再生。JUENEMANN 等[39]在建立短暂性中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型中得出：rhEPO 5 000 IU/kg 的单剂量预处理可显著减少大鼠短暂MCAO 后24 h 缺血半影区域的缺血性病变体积并增加局部脑血流。

3.3 EPO 临床试验 在美国对中度至重度HIE的足月新生儿进行的Ⅱ期，多中心、双盲对照试验发现，高剂量的EPO 低温治疗缺氧缺血性脑病可降低MRI 脑损伤，特别是在皮层下区域并改善1 年运动功能[40]。荟萃分析对四项接受预防性rhEPO治疗的随机对照试验中的1 133 名极早产婴儿(约32 周妊娠)进行了分析，结果表明经校正的18～24个月大的MDI评估，预防性rhEPO 改善了早产儿的认知发育，但对其他神经发育结局无影响[41]。JUUL等[42]在对窒息和脑病试验进行的一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照试验中发现EPO在临床前研究中具有神经保护作用，Ⅰ/Ⅱ期试验表明，多次高剂量的EPO可能为足月儿提供抗脑损伤的神经保护。围产期HIE 新生儿使用EPO 可降低脑损伤的风险、脑瘫和认知障碍[43]。但最近有研究表明，从生后24 h 至32 周，对极早产儿进行的高剂量rhEPO 随机、双盲试验对2 岁时严重神经发育障碍或死亡的风险没有影响[44]。目前促红细胞生成素生成素的神经保护作用大多通过动物实验证实，人体实验方面的研究较少，甚至有部分实验中发现rhEPO没有神经保护作用，仍需要大量的临床研究去证实。

4 结语

rhEPO 是一个有潜在临床应用价值的神经保护剂，其经济、实用，在治疗肾性贫血中临床应用多年。然而，关于EPO在新生儿神经保护中的许多问题仍无确切结论，还有待进一步研究最佳剂量、给药间隔和时间等。部分实验认为大剂量的促红细胞生成素有相关的副作用，如血栓形成、红细胞增多症、继发性梗死等，促红细胞生成素的衍生物应运而生，具有有益的免疫调节和组织保护作用，同时缺乏促红细胞生成素的不良副作用，研究证实其同样存在神经保护作用，这为日后脑损伤治疗提供新的药物选择。