基于网络药理学及体内实验探讨温肾通络止痛方对原发性骨质疏松症小鼠MAPK信号通路的调节作用

韩秋革，员浬，刘孟敏✉，郭杨，马勇，孙杰，王礼宁，潘娅岚

（1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室，江苏 南京 210023）

原发性骨质疏松症（primary osteoporosis，POP）是一种以低骨量、骨组织退化和骨微结构破坏为特征，由多种病因引起的骨代谢障碍类疾病，它会导致骨强度受损并且增加骨折的风险［1］。全球骨质疏松症患者已超过2 亿，病发率超过25%［2］，已成为严重影响人们身体健康的慢性疾病之一。目前，治疗骨质疏松症的药物主要有两大类：一是促进骨形成的药物，如双膦酸盐、雌激素、降钙素等；二是抑制骨吸收的药物，如甲状旁腺激素、合成类固醇等。尽管这些药物均在治疗骨质疏松方面发挥一定疗效，但都存在着不良反应［3-6］。

中医学认为，POP 属本虚标实之证，病位在肾，本虚以肾为主，涉及肝阴、脾气和气血不足；标实多为气滞血瘀。基于此，马勇等提出在治疗上应以补肾通络为主，兼以益气化瘀、活血通络［7］。温肾通络止痛方具有温阳、通络、除痹、止痛等功效，已在江苏省中医院应用十余年，临床疗效较好［8］。课题组已申请发明专利［9］（申请公布号：CN 107823493 A），并建立了温肾通络止痛方质量控制方法［10］，且研究发现该方能够明显增加去卵巢大鼠血清生化指标OPG/RANKL 比值，抑制破骨细胞活性，促进脂肪细胞分泌外泌体，影响骨髓内BMSC 的成骨与成脂分化，发挥抗骨质疏松作用［7，10］。但该复方组分较多，作用机制尚不明确。基于此，本研究采用网络药理学的方法，通过建立“温肾通络止痛方-活性成分-交集靶点-通路-原发性骨质疏松症”关系，挖掘其潜在的分子作用机制并进行验证，以期为POP的治疗及后续研究提供依据。

1 网络药理学

1.1 温肾通络止痛方活性成分及其潜在靶点的筛选

分别以“附子”“山茱萸”“骨碎补”“淫羊藿”“蛇床子”“薏苡仁”“独活”“羌活”“白芍”“白术”“细辛”“甘草”为关键词，利用TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw. com/tcmsp. php）检索各味中药的活性成分，借助人体药物代谢动力学参数ADME预测筛选，设定参数生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug likeness，DL）≥0.18；利用TCMID（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http：//119.3.41.228：8 000/tcmid/）与BATMANTCM 数据库（http：//bionet. ncpsb. org/batman-tcm/）筛选出狗脊与天麻活性成分及其相关靶点。利用Uniprot将靶点名称标准化。

1.2 原发性骨质疏松症潜在靶点的及药物和疾病交集靶点的获取

以“primary osteoporosis”为关键词，检索OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www. omim. org/）和GeneCards（https：//www. genecards.org/）数据库，设置GeneCards 中相关性分数≥6，整合、去重后靶点即为原发性骨质疏松症潜在靶点。利用R语言VennDiagram 数据包获取药物与疾病潜在靶点的交集。

1.3 构建温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症网络关系图与PPI网络视图

建立复方、药物活性成分以及药物与疾病交集靶点信息文件，将其导入Cytoscape 3.7.2绘制“温肾通络止痛方-活性成分-交集靶点-原发性骨质疏松症”网络视图，并进行网络拓扑学分析。将药物与疾病交集靶点输入至在线数据库STRING 中，选择种属信息为“Homo sapiens”，设置置信度为0.4，获得“stringinteraction. tsv”文件。将其导入Cytoscape 3.7.2 软件中，进行网络拓扑学分析，设定度值（Degree）≥50（度值中位数2倍），筛选核心靶点，并绘制网络图。

1.4 基因本体论和通路富集分析

将药物与疾病交集靶点输入至DAVID 数据库中，选择种属信息“Homo Sapiens”，选择GO 富集过程中的生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（celluar components，CC）与分子生物学功能（molecular function，MF）以及KEGG 通路，筛选具有统计学意义（P＜0.05）的条目，利用微生信在线网站绘图，并进行分析。

2 验证实验

2.1 材料与仪器

SPF 级雌性C57BL/6J小鼠21只，体质量（18±2）g，由南京市青龙山动物繁殖场提供，动物合格证号：SCXK（浙）2019-0002。动物购进后饲养于南京中医药大学实验动物中心，适应性饲养1 周后进行实验，SPF 级条件常规喂养，12 h/12 h 光暗交替，恒温、恒湿，动物自由摄取饲料和饮用水。本项目动物实验方案经南京中医药大学实验动物伦理委员会审查通过（批准号：202107A006）。

苏木素-伊红（HE）染液（南京建成生物工程研究所，批号：D006-1-1）；JNK（CST #9252）、p-JNK（abcam ab76572），ERK、p-ERK 抗体、内参抗体GAPDH、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（美国Proteintech公司，批号分别为11257-1-AP、28733-1-AP、18165-1-AP、SA00001-2）；总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号分别为RC101-01、R223-01、Q711-02）；非变性组织/细胞裂解液（北京Solarbio 公司，批号：R0030）；IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒（南京金益柏生物科技有限公司，批号分别为LA128802H、LA1288 01H）。

Allsheng 型全自动多功能酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司）；VE-180型垂直电泳槽、凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；MAX-TL 型高速冷冻离心机（美国BeckMan 公司）；SCIENTZ-950E 型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技公司）；DM1000 型生物显微镜（德国Leica 公司）；mini Trans-blot cell 型电转印槽系列（美国BioRad 公司）；QuantStudio3 型Realtime PCR 仪（美国ABI 公司）；5200CE 型全自动化学发光图像分析系统（中国Tanon 公司）；Mastercycler nexus型PCR 仪（德国Eppendorf 公司）；Nano-300 型微量分光光度计（山东莱索科技有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 实验药物及制备

温肾通络止痛方由附子8 g、山茱萸10 g、骨碎补30 g、淫羊藿10 g、蛇床子15 g、狗脊10 g、薏苡仁15 g、炒白术10 g、羌活10 g、独活10 g、细辛3 g、天麻6 g、白芍15 g 和炙甘草6 g 组成。实验所用药物均购于江苏省中医院，经南京中医药大学吴德康教授鉴定，均符合2020年版《中华人民共和国药典》的规定。按配伍比例取温肾通络止痛方饮片，加入10 倍量的水煎煮1 h。煎煮的药渣再次加入8 倍量的水煎煮1 h。两次提取的药液合并后过滤，滤液通过旋蒸仪减压浓缩至2 g/mL，4 ℃保存备用。

2.2.2 去卵巢骨质疏松症动物模型制备

21 只SPF 级C57BL/6J 雌性小鼠适应性饲养1 周后，随机分为假手术组（7 只）和造模组（14 只）。假手术组切除卵巢周围相等质量的脂肪组织，造模组均切除双侧卵巢。于术后1 周小鼠情况稳定后开始连续给药8 周。术后各组小鼠均在相同条件下饲养，自由饮水摄食。

2.2.3 分组及给药

将造模组（14只）随机分为模型组（7只）与温肾通络止痛方组（7只），根据人与小鼠体表面积换算法［11］确定小鼠给药剂量为22 g/kg。给药灌胃体积为15 mL/kg，假手术组与模型组给予同等体积生理盐水。连续给药8周。

2.3 观测指标

2.3.1 HE染色法观察股骨组织形态学变化情况

采集股骨组织，放置4%多聚甲醛中固定24 h 后将其转移至10%EDTA 脱钙液中脱钙4 周。二甲苯溶液透明，常规石蜡包埋。切取5 μm 厚的薄片后，苏木素染色，1%盐酸-乙醇分化，1%氨水反蓝，伊红染色，中性树脂封片，在倒置显微镜下观察骨组织的病理结构。

2.3.2 ELISA法检测小鼠血清IL-6、TNF-α水平

所得血清按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤检测IL-6、TNF-α的表达水平。

2.3.3 Real-time PCR 法检测胫骨组织中相关mRNA表达

取骨组织20 mg，液氮下充分研磨至粉末，使用离心柱提法取骨组织提取总RNA，提取的总RNA 首先去除基因组中的DNA，然后进行反转录，引物序列见表1。以上步骤均按照产品说明书进行操作。并按诺唯赞试剂盒说明扩增cDNA。使用2-ΔΔct方法计算mRNA 的相对表达量。

表1 PCR引物序列

2.3.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测胫骨组织中蛋白表达

提取小鼠胫骨组织中总蛋白，BCA测定蛋白含量。BCA 试剂盒测定各组蛋白浓度。后续进行电泳，转膜，5%奶粉封闭2 h，一抗ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）4 ℃过夜，洗膜后分别加入对应的二抗（1∶10 000，室温孵育2 h，ECL上机显影，使用Image J软件对图像进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示蛋白相对表达量并进行统计分析。

2.4 统计学分析

采用SPSS 19.0 对实验数据进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较行单因素方差分析（oneway ANOVA），组间两两比较采用 Student-NewmanKeuls（SNK）检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 网络药理学结果

3.1.1 温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的活性成分与靶点的筛选结果

经TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 数据库检索并筛选后，发现温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症活性成分共203 个。其中附子3 个，山茱萸6 个，骨碎补12个，淫羊藿17个，蛇床子11个，狗脊19个，羌活7个，独活5个，细辛4个，薏苡仁4个，炒白术3个，白芍13个，炙甘草83个，天麻16个。温肾通络止痛方中各味中药重复成分信息见表2。

表2 温肾通络止痛方各味中药中重复成分信息

通过GeneCards 与OMIM 数据库检索、筛选、去重后共获得1 817 个疾病靶点，其中GeneCards 数据库中筛选相关性分数≥6 的疾病靶点共1 428 个，OMIM 数据库中共389 个。利用R 语言VennDiagram 数据包筛选获得药物与疾病交集靶点共154个。

3.1.2 温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症网络关系图

利用Cytoscape 3.7.2绘制“温肾通络止痛方-活性成分-交集靶点-原发性骨质疏松症”网络视图，共有329 个节点（包括复方与疾病名称，173 个活性成分，154个靶标基因），1 175条边，网络密度为0.018，网络异质性为2.681。除复方和疾病节点外，该网络图度值平均值为6.2，其中29个靶标基因、18个活性成分大于度值平均值，靶标基因中ESR1的节点度最高，其次为AR、PPARG、ESR2等。活性成分中山柰酚的节点度最高，其次为槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等。见图1。

图1 温肾通络止痛方-活性成分-交集靶点-原发性骨质疏松症网络视图

3.1.3 PPI网络视图构建

利用STRING 在线数据库分析药物与疾病交集靶点，并利用插件Network Analyzer进行网络拓扑学分析。PPI 网络中共153 个节点（置信度≥0.4），2 196 条边。核心靶点网络图中共有25个节点，282条边，见图2。按照度值由高到低核心靶标基因包括INS、GAPDH、AKT1、IL6等，见表3。度值越大表示与温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的关系越紧密。

表3 核心靶点信息

图2 PPI网络图节点拓扑筛选过程

3.1.4 基因本体论与通路富集分析

GO 富集分析结果表明具有统计学意义的功能注释过程共646个。其中分子生物学功能（MF）有104个条目，细胞组成（CC）有63 个条目，生物学过程（BP）有479 个条目，见图3。BP 占较大比例，发挥主要作用（图3A）。按照P值由小到大排列，对BP、CC、MF前十位注释过程进行作图（图3B），并对BP 前20 个功能注释过程绘制条形图（图3C），颜色越浅表示P值越小，各生物学过程差异越显著；条形长度越长表示富集在此过程的基因数目越多。

在KEGG 富集分析中，共有90 条差异具有统计学意义（P＜0.05）的信号通路。其中65条信号通路具有显著性差异，共有32 条通路与原发性骨质疏松症有关。包括PI3K/Akt、TNF 信号通路、MAPK 信号通路等。并将其按照P值由小到大进行排列，对前二十条通路绘制气泡图（图3D）。图3D 中圆的颜色越深表示P值越小，通路差异越显著，圆的直径越大表示富集在这一通路上的基因数目越多。

图3 GO与KEGG分析

3.2 温肾通络止痛方对原发性骨质疏松症小鼠的作用

3.2.1 HE染色结果比较

假手术组小鼠股骨骨小梁形态完整，排列紧密规整，小梁间连接呈网状，骨髓腔较小，骨髓细胞数量丰富。模型组小鼠骨小梁形态结构稀疏，数量明显减少，排列紊乱，骨髓腔变大。温肾通络止痛方组小鼠骨小梁结构较前完整，数量增多，排列尚规则，连续完整性较好，骨小梁间隙略有增大。见图4。

图4 各组小鼠股骨组织HE染色图（×100）

3.2.2 ELISA检测IL-6、TNF-α表达水平

与假手术组比较，模型组小鼠IL-6、TNF-α 表达水平明显升高（P＜0.01），温肾通络止痛方可降低模型组小鼠IL-6、TNF-α 的表达水平（P＜0.01）。见表4。

表4 各组小鼠血清IL-6、TNF-α表达水平的比较（±s，n=3）

表4 各组小鼠血清IL-6、TNF-α表达水平的比较（±s，n=3）

注：与假手术组比较，2）P ＜0.01；与模型组比较，4）P ＜0.01。

组别假手术组模型组温肾通络止痛方组TNF-α（pg/mL）261.41±6.80 658.42±9.562）245.36±6.014）剂量——22 g/kg IL-6（pg/mL）65.89±4.60 110.58±4.182）81.66±4.154）

3.2.3 qPCR检测IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的水平

与假手术组比较，模型组小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平升高（P＜0.01），Runx2 mRNA水平降低（P＜0.01）；温肾通络止痛方能够降低模型组小鼠IL-6、TNF-α mRNA 水平（P＜0.01），升高Runx2 mRNA 表达水平（P＜0.01）。见表5。

表5 各组小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表达水平的比较（±s，n=3）

表5 各组小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表达水平的比较（±s，n=3）

注：与假手术组比较，2）P ＜0.01；与模型组比较，4）P ＜0.01。

Runx2 1.00±0.10 0.45±0.042）0.72±0.014）组别假手术组模型组温肾通络止痛方组剂量——22 g/kg IL-6 1.00±0.10 9.99±0.292）8.46±0.674）TNF-α 1.00±0.13 12.21±0.302）11.08±0.164）

3.2.4 Western blot 法检测小鼠胫骨组织中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 相对表达水平升高（P＜0.05，P＜0.01），温肾通络止痛方可降低模型组小鼠p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达水平。见表6，图5。

图5 各组小鼠ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达电泳图

表6 各组小鼠胫骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达的比较（±s，n=3）

表6 各组小鼠胫骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达的比较（±s，n=3）

注：与假手术组比较，2）P ＜0.01；与模型组比较，3）P ＜0.05，4）P ＜0.01。

组别假手术组模型组温肾通络止痛方组p-ERK/ERK 0.98±0.03 1.18±0.042）1.09±0.023）剂量——22 g/kg p-JNK/GAPDH 0.69±0.00 1.27±0.012）0.85±0.004）JNK/GAPDH 0.32±0.00 0.34±0.002）0.32±0.003）p-JNK/JNK 2.12±0.01 3.75±0.042）2.71±0.024）p-ERK/GAPDH 1.44±0.44 2.22±0.072）1.68±0.044）ERK/GAPDH 1.54±0.03 1.88±0.442）1.48±0.034）

4 讨论

原发性骨质疏松症是现代临床中常见的骨科疾病，归属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴，《黄帝内经》载：“女子七岁，肾气盛，齿更发长……七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。丈夫八岁，肾气实，发长齿更……七八，肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极”［12］。

本研究通过网络药理学方法对温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的潜在作用机制进行探究，共筛选出203个活性成分与154个靶标基因，其中活性成分主要为山柰酚、槲皮素、木犀草素等，靶标基因主要为IL-6、TNF-α 等。山柰酚能够调节Ca2+代谢平衡，升高Ⅰ型原胶原羟基端延长肽（PICP），降低Ⅰ型胶原C端肽（ICTP）水平，促进骨胶原生成，减少骨小梁丢失，起到对卵巢去势大鼠的治疗作用［13］。槲皮素能够使去卵巢骨质疏松症组大鼠血液中CTX、TRACP-5b 含量显著降低，有效抑制破骨分化，改善骨质疏松症［14］。木犀草素通过抑制ATF2，p38 MAPK 和NFATc1 的表达来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，发挥抗骨质疏松作用［15］。

炎性因子IL-6、TNF-α 等在原发性骨质疏松症中扮演着重要的角色［16］。在骨微环境中有许多细胞能够产生IL-6，包括成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞等。IL-6 缺失小鼠表现出卵巢切除诱导的骨丢失和破骨细胞形成减少［17］。TNF-α 被认为是最强的抗肿瘤因子。各种类型的细胞均可产生TNF-α，包括巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞等。TNF-α在分化的某些阶段能抑制成骨细胞的活性，并刺激破骨细胞的增殖和分化，促进造血干细胞向破骨细胞分化，增加巨噬细胞中RANK 和RANKL 水平，从而激活多个靶点如MAPK、TRAF2、JNK、NF-κB，介导破骨细胞的增殖和分化的因子［18］。本实验结果显示，在小鼠切除卵巢后血清中IL-6、TNF-α 的表达水平以及胫骨组织中IL-6、TNF-α的mRNA的表达水平显著升高，由此提示雌激素能够抑制IL-6、TNF-α的表达水平。本研究表明，温肾通络止痛方可抑制IL-6、TNF-α的表达，此外，温肾通络止痛方组TNF-α 的表达水平与假手术组表达水平相当，甚至更低，这表明去卵巢小鼠血清中TNF-α的升高不仅来源于手术应激，还来源于去卵巢引发的骨代谢失衡。温肾通络止痛方不仅可以纠正骨代谢失衡，还能减轻手术导致的炎症反应，这体现了中药多靶点治疗的特点，并可以为后续研究提供一个新的方向。

KEGG 富集分析可知，与POP 相关的信号通路主要有PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路与破骨细胞分化等。PI3K/Akt信号通路是细胞增殖、转移、黏附及死亡过程中的重要调节者，在正常的生理条件下，PI3K/Akt 信号通路能够选择性地影响成骨、破骨细胞的生理功能，维持骨组织的动态平衡。研究表明，调控PI3K/Akt 信号通路能够促进骨髓基质细胞的增殖，阻止炎症的发生和发展，促使骨矿化，提高骨生物力学，减轻绝经后骨质疏松症的临床症状［19-20］。MAPKs通路能够调控从增殖分化到细胞凋亡等多种过程，积极参与免疫防御和炎症反应，该通路主要有Erk1/2、p38 和JNK 三条途径［21］。通过MAPK 激活将细胞外刺激信号传递给适当的细胞内分子已被证实是调节破骨细胞分化和骨重建所必需的过程。破骨细胞阶段阻断JNK活性导致TRAP阳性细胞逆转为TRAP阴性细胞（代表破骨细胞前体），即使在持续存在RANKL 的情况下也是如此，说明JNK 途径是维持破骨细胞分化所必需的过程，直至融合［22］。有研究表明可通过抑制MAPK 信号通路抑制其下游因子NFATC1和c-fos，并促进成骨相关因子Runx2等的表达发挥抗骨质疏松作用［23］。本实验通过免疫蛋白印迹方法检测p-JNK、JNK、p-ERK、ERK 的蛋白表达，结果显示温肾通络止痛方能够降低p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 的相对表达。这也提示温肾通络止痛方能够通过调节TNF-α、IL-6 因子，激活MAPK 信号通路，影响炎症反应治疗骨质疏松症。此外，本实验也通过HE 染色与qPCR 检测，发现温肾通络止痛方能够增加POP 小鼠骨小梁，使其排列较为规整且致密，骨髓细胞较模型组增加，骨髓腔间隙减小，升高Runx2 的mRNA 表达，证明该复方具有抗POP的作用。

综上所述，温肾通络止痛方可通过多成分、多靶点、多通路的方式来调控骨代谢，维持机体骨稳态，并通过降低IL-6、TNF-α的表达水平，调节MAPK信号通路影响炎症反应等过程，从而调节骨稳态，发挥治疗作用。本研究利用网络药理学与实验验证，为原发性骨质疏松症的治疗及温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的后续深入研究提供了科学依据。