半枝莲多糖组分抗肿瘤作用和免疫调节的实验研究

林怡彤，宋高臣

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma，PHC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织的统计数据，2020年全球有90.6万新诊断PHC病例和83万PHC死亡病例，是世界上第六大常见肿瘤和人类第三大癌症相关死亡原因［1］。肝细胞癌约占PHC 中的75%～85%，是最重要的病理类型［1］。目前，手术切除和肝移植仍然是治疗肝细胞癌最有效的策略，特别是对于预后较好的早期患者［2］，但由于肝细胞癌的临床症状出现较晚且肿瘤的高侵袭性，许多患者在确诊时已处于晚期，错过了最佳的手术治疗机会［3］。因此，积极寻找高效、低毒性的抗癌剂成为治疗PHC的重要研究方向。

半枝莲属唇形科，全株入药，味辛微苦，性寒，归肺、肝、肾经，具有清热解毒、散癖止血、利尿消肿等功效［4］。多糖类是通过糖苷键结合超过10个单糖类而形成的结构复杂的生物聚合物［5］。从不同的中草药中分离得到的多糖具有多种生物学功能，如抗肿瘤［6］、抗氧化［7］、抗病毒［8］和免疫调节［9］等作用。多糖类成分不仅能增强人体的免疫功能，促进巨噬细胞和T 淋巴细胞的免疫水平，还能促进细胞因子的产生，如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等，从而提高抗肿瘤效果［10］。本课题组前期对半枝莲多糖的提取纯化工艺进行了优化并确定其抗肝癌活性的有效成分，发现半枝莲多糖组分（SBP-2A）对肝癌HepG2细胞具有明显的抑制作用，但其对小鼠体内肝癌的作用及机制尚不明确。因此，本实验观察半枝莲多糖组分（SBP-2A）在体内对H22 荷瘤小鼠的抑瘤作用及细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）、STAT1 蛋白表达的影响，为阐明半枝莲多糖的抗肿瘤作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，6～8周龄，体质量（20±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001。动物饲养环境温度为21～25 ℃，湿度45%～55%。所有动物自由进食标准饲料和饮用水，适应环境1周后开始实验。

1.2 样品、试剂及主要仪器

半枝莲全草（河北金叶子药业有限公司）；H22 细胞株（无锡鑫润生物科技有限公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries 公司，批号：2140301）；黄芪多糖（北京美迪克斯生物技术有限公司，批号：021001B）；BCA蛋白浓度测定盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号：100918190318）；STAT1兔源性一抗（沈阳万类生物科技有限公司，批号：L02222273）；IFN-γ ELISA 试剂盒（江苏苏酶科生物科技有限公司，批号：MK2918A）；酶标仪（美国Molecular Devices公司）；电泳槽（北京六一仪器厂）；电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 SBP-2A的提取、分离和纯化

将半枝莲全草清洗干净，放入60 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒温，粉碎，过40目筛得样品粉末，取半枝莲干燥粉末按照1∶4的比例置于4倍体积95%乙醇中搅拌，室温静置3 h，收集沉淀，沉淀重复上述去杂操作10次，将沉淀置于60 ℃的干燥箱中干燥24 h；沉淀用Sevage 法除蛋白，加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，洗涤数次，大孔树脂脱色，过滤分离提取液后浓缩至原体积的1/4。-50 ℃下真空干燥制得半枝莲粗多糖。DEAE-52纤维素柱分离得半枝莲多糖2组分，Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱分离得半枝莲多糖2A组分，-40 ℃下预冻12 h，置冷冻干燥机中36 h，干燥器保存备用。

1.3.2 动物造模、分组与给药

将30 只雄性C57BL/6 小鼠随机分为模型组、黄芪多糖组和SBP-2A 低、中、高剂量组，每组6 只。常规方法复苏H22 小鼠肝癌细胞，各组小鼠均在右前肢腋窝皮下注射0.2 mL 1×107个/mL 细胞密度的H22 肝癌细胞，建立H22肝癌模型。接种24 h后，模型组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水（0.1 mL/10 g），SBP-2A低、中、高剂量组分别腹腔注射25、50、100 mg/kg SBP-2A，黄芪多糖组腹腔注射100 mg/kg黄芪多糖，每日1次，连续给药干预12 d。

1.3.3 对肿瘤抑制和免疫器官指数的影响

末次给药24 h后，小鼠禁食不禁水，称体质量后处死小鼠，剥离瘤块组织，取出脾脏和胸腺，用滤纸吸净血液分别称重，计算肿瘤抑制率和免疫器官指数。

抑瘤率（%）=（1-实验组瘤质量/模型组瘤质量）×100%

免疫器官指数=免疫器官质量（mg）/体质量（g）

1.3.4 ELISA法测定荷瘤小鼠血清中IFN-γ的表达

末次给药后24 h 后，眼球取血，收集血液，静置30 min，离心，取上清，ELISA法测定血清中IFN-γ含量，具体操作步骤按照IFN-γ ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.5 蛋白免疫印迹法检测STAT1蛋白的表达

剪取0.025 g 肿瘤组织，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1 次，加入250 μL 的RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白，用苯二甲苄基氯化铵（BCA）蛋白浓度测定法进行蛋白定量，通过聚丙烯酰胺电泳按相对分子质量大小分离，然后转移到杂交膜上，加入50 mL 封闭液，封闭2 h，加入一抗（1∶1 000），放入摇床，4 ℃过夜，将蛋白条带用TBST 洗涤3次后，用稀释后的二抗（1∶5 000）与膜共同孵育60 min。再用TBST 洗涤3 次后，用化学发光试剂曝光显影，扫描底片，用Image J 软件计算灰度值，以β-actin为内参，对比分析瘤体组织中的蛋白表达。

1.3.6 统计学方法

采用Graphpad Prism8统计软件进行数据分析和处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间均数进行单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组对荷瘤小鼠的抑瘤作用比较

与模型组比较，半枝莲多糖组分（SBP-2A）低、中、高剂量组及黄芪多糖组瘤重显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；不同剂量SBP-2A 对H22 小鼠表现出不同的抑瘤作用，其中以中剂量组效果最佳；SBP-2A中剂量组对H22肝癌小鼠的抑瘤率为38.67%。见表1。

表1 SBP-2A对H22荷瘤小鼠瘤重的影响（±s，n=6）

表1 SBP-2A对H22荷瘤小鼠瘤重的影响（±s，n=6）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

抑瘤率（%）—15.42 38.67 29.95 42.32组别模型组SBP-2A低剂量组SBP-2A中剂量组SBP-2A高剂量组黄芪多糖组剂量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100瘤重（images/BZ_9_1380_2696_1401_2739.png±s，g）1.291±0.096 1.092±0.160*0.792±0.072**0.905±0.084**0.745±0.080**

2.2 各组荷瘤小鼠免疫学功能的比较

与模型组比较，SBP-2A 中剂量组胸腺指数有显著提高（P＜0.05）；给药各组脾脏指数均较模型组有显著提高（P＜0.01），其中SBP-2A 高剂量组效果最佳；SBP-2A 低、中、高剂量组的IFN-γ 水平呈剂量依赖性显著升高（P＜0.01）。黄芪多糖组与模型组相比，各免疫学指标均有显著回升（P＜0.01）。见表2。

表2 SBP-2A对荷瘤小鼠免疫学功能的影响（±s）

表2 SBP-2A对荷瘤小鼠免疫学功能的影响（±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别模型组SBP-2A低剂量组SBP-2A中剂量组SBP-2A高剂量组黄芪多糖组IFN-γ（pg/mL）51.59±1.14 56.24±1.72**57.17±1.62**60.54±0.67**70.50±0.63**n66666剂量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100脾脏指数（mg/g）6.14±0.20 11.85±0.32**11.29±0.23**13.27±0.17**7.084±0.05**胸腺指数（mg/g）1.63±0.06 2.07±0.59 2.54±0.09*1.74±0.06 2.71±0.82**

2.3 各组荷瘤小鼠STAT1蛋白表达的比较

Western blot 结果显示，与模型组比较，各剂量SBP-2A处理的小鼠瘤组织中的STAT1蛋白表达量均显著增加，其中高剂量组最为明显（P＜0.05）。见图1。提示SBP-2A 可能通过提高STAT1 蛋白水平来抑制小鼠肝癌肿瘤的生长。见图1和表3。

图1 各组荷瘤小鼠肿瘤组织STAT1蛋白表达的比较

表3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织STAT1蛋白表达量的比较（±s，n=6）

表3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织STAT1蛋白表达量的比较（±s，n=6）

注：模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别模型组SBP-2A低剂量组SBP-2A中剂量组SBP-2A高剂量组黄芪多糖组STAT1 0.684±0.066 0.694±0.142 0.989±0.256 1.212±0.096*1.384±0.159**剂量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100

3 讨论

多糖是许多植物的活性成分之一，对癌症具有低毒高效的治疗作用［11］。如黄芪、人参、五味子等多味中药的多糖组分均已被证明对肿瘤具有良好的抑制作用。研究发现，半枝莲多糖可抑制多种肿瘤，如结直肠癌［12-13］、肝细胞癌［14］、肺癌［15-16］、卵巢癌［17］和乳腺癌［18］等。但关于半枝莲多糖的研究主要集中在粗多糖方面，关于半枝莲多糖分离纯化的组分研究较少，且其对肝癌肿瘤生长的免疫调节作用仍不清楚。因此，本研究探讨半枝莲多糖组分对H22 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，并探索潜在的免疫调节功能。

课题组前期研究发现，SBP-2A 在体外实验显示良好的抗肝癌效果，作为先前研究的延续，本实验通过H22 肝癌小鼠模型，探讨SBP-2A 在H22 荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性和可能潜在机制。首先建立H22肝癌小鼠模型，SBP-2A 干预治疗后处死小鼠，测定瘤体、脾脏、胸腺重量，计算出肿瘤抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。结果表明，SBP-2A各剂量组均可抑制瘤体生长，增加肝癌小鼠免疫器官指数，其中SBP-2A中剂量组小鼠抑瘤率高于SBP-2A低、高剂量组，可能与SBP-2A中剂量组小鼠胸腺指数最高有关，提示SBP-2A 可能通过增加小鼠免疫器官质量，增强小鼠免疫功能，从而达到抑制肿瘤生长的效果。细胞因子IFN-γ 已被证明在调节抗肿瘤免疫反应以及抑制肿瘤生长方面发挥着重要的作用，并已在临床前、体外和体内以及恶性疾病免疫治疗的患者中进行了广泛的测试［19］。在体内实验中，注射SBP-2A 的H22荷瘤小鼠血清IFN-γ 水平显著升高，提示SBP-2A可能通过刺激H22荷瘤小鼠的细胞因子分泌，发挥间接的抗肿瘤效果。STAT1 是STATs蛋白家族的成员之一，经磷酸化激活的STAT1蛋白向核转移，调节靶基因的表达，参与细胞周期进展、细胞凋亡、肿瘤血管生成和免疫监视等多种生物学过程［20］。本研究观察到H22肝癌小鼠经过SBP-2A治疗后，其肿瘤组织的STAT1 蛋白水平显著增加（P＜0.05），以高剂量组最为明显。提示SBP-2A 可能通过提高STAT1蛋白水平从而抑制肿瘤生长。

综上所述，本研究证实从半枝莲多糖中分离纯化的SBP-2A 具有抑制H22 荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，该作用可能与免疫调节功能有关，但具体的作用机制还有待进一步研究。