不同剂量细辛水煎液抗炎镇痛与肾毒性研究

贾羲，付智慧，茹庆国，聂安政✉

（1. 郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052；2. 河南省食品药品检验所，河南 郑州 450008）

细辛来源于马兜铃科植物华细辛（Asarum sieboldiiMiq.）、北细辛［Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var. mandshuricum（Maxim.）Kitag.］或汉城细辛（Asarum sieboldiiMiq. var. seoulense Nakai）的干燥根和根茎，后两种习称“辽细辛”。细辛最早记载于《神农本草经》，主要功效为解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮，临床多用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛、痰饮喘咳等［1-3］。《本草纲目》中提及“细辛不过钱，过钱命相连”［4］，细辛的毒性便开始受到关注，细辛中所含马兜铃酸具肾毒性，长期摄入可致使肾小管功能受损，甚至有诱发肾癌的风险，印证了细辛的肾毒性［5-9］。《中华人民共和国药典》将细辛用量限制在1～3 g，但在临床中为了达到特定疗效，常常超剂量使用，如国家中医药管理局推荐的新冠肺炎防疫通用方清肺排毒汤中，细辛用量为6 g，而笔者前期研究发现细辛煎剂的中毒剂量为6～15 g。作为毒效并存的药物，临床如何基于疗效与毒性把握细辛用量？因此，笔者拟基于细辛的抗炎、镇痛作用与肾毒性作用初步探讨细辛的“量-毒-效”关系，旨在为细辛的临床合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细辛水煎液的制备

细辛购买于河南尚华堂药业股份有限公司（批号：201001），经郑州大学第一附属医院王娟教授鉴定为马兜铃科植物华细辛（Asarum sieboldiiMiq.）的根及根茎。称细辛1 200 g，加蒸馏水6 000 mL煎煮60 min，过滤，将药渣再加水3 000 mL煎煮60 min，再次过滤，将2次滤液合并，减压旋转蒸发浓缩，小鼠给药前将水煎液分别以蒸馏水稀释至1.2、0.6、0.3、0.15 g/mL（生药量）。

1.1.2 实验动物

昆明小鼠（清洁级）180只，体质量（20±2）g，雌雄各90 只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2020-0004。饲养条件：室内温度（23±1）℃，湿度（45±5）%，标准12 h光照/12 h黑暗节律，普通清洁级鼠饲料与饮水。

1.1.3 试剂及仪器

二甲苯（上海麦克林生化科技有限公司，批号：20150508）；冰醋酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号：920827）；地塞米松（北京索莱宝科技有限公司，国药准字H44020701）；苏木素-伊红染液（德国Sigma公司）；打孔器（上海泽雅科教仪器有限公司，型号：INS500075-5）；电子天平（上海力辰仪器科技有限公司）；BX53显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 醋酸扭体实验

昆明小鼠适应性饲养5 d 后，取60 只（雌雄各30 只），按体质量随机分为对照组、阳性药组以及细辛水煎液剂量1、2、3、4组，共6组，每组10只。阳性药组小鼠灌胃1.5 mg/kg地塞米松，细辛水煎液剂量1、2、3、4组小鼠分别灌胃24、12、6、3 g/kg 的细辛水煎液，对照组小鼠给予蒸馏水，各组给药量均为20 mL/kg。每日灌胃1 次，连续灌胃7 d，末次灌胃1 h 后小鼠腹腔注射1%的醋酸0.2 mL，观察并记录15 min 内每组小鼠扭体次数。

1.2.2 耳廓肿胀实验

小鼠分组与灌胃情况同醋酸扭体实验。每日灌胃1 次，连续灌胃7 d，末次灌胃1 h 后将0.05 mL 二甲苯均匀涂抹于小鼠右耳的两面，左耳对应位置涂抹等体积的生理盐水，0.5 h 后脱颈椎处死小鼠，将小鼠左右两耳剪下，叠放对齐，用打孔器在左右耳相同部位打孔，取下称重。

肿胀度（g）=右耳质量-左耳质量

1.2.3 热板法实验

小鼠分组与灌胃情况同醋酸扭体实验。每日灌胃1 次，连续灌胃给药7 d，于末次灌胃30、60 min 后分别测量并记录小鼠痛阈值。

1.2.4 肾脏组织苏木精-伊红（HE）染色

每批动物实验结束后，取同一位置肾脏组织固定在4%多聚甲醛中，分别采用70%、75%、80%、90%、95%乙醇和无水乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明处理后用石蜡进行包埋。包埋好的肾脏组织以4 μm 厚度标准切片，进行常规脱蜡处理，分别以无水乙醇及95%、80%乙醇进行复水，然后用纯水浸泡5 min 后，进行苏木精-伊红染色，脱水后中性树胶封片，风干，光学显微镜下观察组织小鼠肾脏病理形态。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，不同分组之间进行单因素方差分析比较组间差异；各组方差齐性条件下采用Bonferroni法进行两两比较，各组方差不齐情况下采用Dunnett's T3 法进行两两比较。P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠耳廓肿胀度变化情况比较

阳性药组小鼠耳廓肿胀度较对照组显著降低（P＜0.05）；细辛水煎液剂量1、2、3、4组肿胀度较对照组均显著降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组小鼠耳廓肿胀度比较（±s）

表1 各组小鼠耳廓肿胀度比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别对照组阳性药组细辛水煎液剂量1组细辛水煎液剂量2组细辛水煎液剂量3组细辛水煎液剂量4组肿胀度（g）0.025 3±0.002 8 0.021 3±0.002 5*0.016 5±0.004 3**0.012 5±0.001 2**0.014 2±0.002 4**0.016 9±0.003 7**n 10 10 10 10 10 10剂量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.2 各组小鼠扭体次数变化情况比较

小鼠在造模后15 min，阳性药组、细辛水煎液剂量1、2 组扭体次数较对照组显著降低（P＜0.01 或P＜0.05），其余各组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠扭体次数比较（±s）

表2 各组小鼠扭体次数比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别对照组阳性药组细辛水煎液剂量1组细辛水煎液剂量2组细辛水煎液剂量3组细辛水煎液剂量4组扭体次数（次）19.80±2.00 13.80±2.00**14.20±2.24**17.30±1.70*18.60±2.00 19.80±2.00 n 10 10 10 10 10 10剂量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.3 各组小鼠痛阈值变化情况比较

给药后30 min，阳性药组、细辛水煎液剂量1组小鼠痛阈值较对照组显著升高（P＜0.05或P＜0.01），其余各组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；给药后60 min，各给药组痛阈值较对照组均显著降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠痛阈值比较（±s）

表3 各组小鼠痛阈值比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别n 剂量对照组阳性药组细辛水煎液剂量1组细辛水煎液剂量2组细辛水煎液剂量3组细辛水煎液剂量4组痛阈值（s）给药后30 min 16.54±2.02 18.85±1.55*22.75±3.56**15.82±3.55 17.13±1.04 15.32±1.29给药后60 min 13.81±1.03 21.11±1.43**25.22±3.30**20.30±3.31**19.04±1.74**16.96±1.54**10 10 10 10 10 10—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.4 各组小鼠肾脏病理变化情况比较

对照组小鼠肾组织表面被膜由厚薄均匀的致密结缔组织构成，肾实质为浅层皮质和深层髓质，皮质髓质分界明显，皮质中肾小球分布均匀，肾小球中细胞数量以及基质均匀，肾小管排列紧密，间质无明显增生，未见明显的炎性改变；与对照组相比，小鼠耳廓肿胀实验、醋酸扭体实验、热板法实验中细辛水煎液剂量1、2 组的肾组织均出现大量的肾小管与集合管轻度扩张，肾小管上皮细胞水肿，上皮扁平化细胞肿胀，胞质疏松淡染；其余各组未见明显变化。见图1。

图1 不同剂量的细辛水煎液对小鼠肾组织的影响（HE染色，×200）

3 讨论

细辛始载于《神农本草经》，临床应用广泛，《伤寒杂病论》中收载含细辛的中药方剂19 首［10］，《备急千金要方》中记载含细辛方剂6 首［1］，清代共发现373 首含细辛的中药方剂［11］，2020 版《中华人民共和国药典》中共收载含细辛中药制剂42 首［12］。自2020年清肺排毒汤（含细辛6 g）被推荐成为首个防疫通用方并广泛应用于临床。但研究显示，细辛临床毒性反应众多［13］，其临床应用安全性受到广泛关注。临床对细辛应用颇具争议，有欲取速效而超量使用，亦有因恐惧毒性而弃之不用者，究其原因，都是对细辛毒-效关系的认识模糊。本研究讨论不同剂量下的细辛的毒-效关系，为细辛毒-效关系的深入探讨奠定基础，同时也为临床细辛汤剂用量的把控提供参考。

本实验结果显示，24、12、6、3 g/kg剂量的细辛水煎液均可显著抑制致炎物引起的小鼠耳廓肿胀，并能明显降低小鼠耳肿胀度（P＜0.01）；24、12 g/kg 剂量的细辛水煎液可显著减少醋酸所致的小鼠疼痛扭体次数，延长小鼠扭体潜伏期（P＜0.05 或P＜0.01）；给药后30 min，24 g/kg 剂量的细辛水煎液开始显著提升小鼠痛阈值；给药后60 min，24、12、6、3 g/kg 剂量的细辛水煎液均可显著提升小鼠的痛阈值。连续给药7 d 后，24、12 g/kg 剂量的细辛水煎液可对小鼠的肾脏产生轻度的损伤，6、3 g/kg 剂量的细辛水煎液对肾脏影响较小。上述结果表明，3～24 g/kg剂量的细辛水煎液均具有显著的抗炎、镇痛作用，连续给予12～24 g/kg剂量的细辛水煎液7 d可能会产生轻度肾损伤。研究发现细辛脂素、甲基丁香酚是细辛抗炎镇痛的主要活性成分，而马兜铃酸、黄樟醚是细辛的主要毒性成分，其中马兜铃酸是主要的肾毒性成分。本研究结果提示临床应用细辛时，应从小剂量开始，疗效不佳时逐渐增加剂量，当使用大剂量细辛时，应当适当配伍保护肾脏的中药或者抑制马兜铃酸溶出的中药从而达到减毒之效［14-17］。

本研究基于抗炎镇痛与肾毒性初步探讨了细辛水煎液“量-毒-效”关联关系，发现12 g/kg 细辛水煎液连续给药7 d即可使肾脏组织发生病理变化，印证了细辛的肾毒性。基于此，笔者认为：①应在6～12 g/kg 范围内设置多种浓度细辛水煎液剂量组，深入阐释细辛“量-毒-效”关系；②可基于肝、肾、肺毒性多维联合阐释细辛的“量-毒-效”关系；③应基于不同的给药疗程阐明细辛水煎液“时-毒-效”关系；④采用液质联用明确细辛水煎液“毒-效”成分，基于“毒-效”成分探讨细辛减毒增效方法。