基于网络药理学和分子对接技术探究半夏治疗肺癌的作用机制

熊常州，韩坤余，陈彦蓓，刘卫，张哲，马帅，牛华涛✉

（1. 成都中医药大学，四川 成都 610075；2. 云南中医药大学，云南 昆明 650021；3. 云南省肿瘤医院，云南 昆明 650118）

原发性支气管肺癌（简称肺癌）是指起源于呼吸上皮细胞的恶性肿瘤，目前居全球癌症发病率的第二位，是全球致死率最高的癌种。2020年全球肺癌新发病例共2 206 771 例（占癌症发病总数的11.4%），死亡病例共1 796 144例（占癌症死亡总数的18.0%）［1］。肺癌的病理分型主要为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，早期临床症状以咳嗽、咳痰和咯血为主。治疗措施主要包括根据患者肿瘤组织学特点、肿瘤分期及患者特异性情况采取外科手术、化学药物治疗、放射治疗和分子靶向治疗等。由于其早期临床症状易被患者忽视，多数患者确诊时已是晚期导致治疗并不理想［2-3］。然而以上治疗方案在治疗过程中均存在一定局限性，如手术的某些禁忌症、化疗及放疗的不良反应、分子靶向治疗的耐药性等［4］。

中医学中并无肺癌之名，根据其临床症状可归属于“咳嗽”“咯血”“肺积”“息贲”“癌病”等范畴。如宋代《济生方·癥瘕积聚门》中提到：“息贲之状，在右胁下，大如覆杯，喘息奔溢，是为肺积”，《圣济总录》中也指出：“肺积息贲气胀满咳嗽，涕唾脓血”，这些均与肺癌的临床表现类似。在一些对肺癌患者体质的调查研究中发现，痰湿体质是肺癌患者主要的体质之一［5-6］。多位国医大师也认为痰湿是肺癌发病的主要病机之一，肺癌的辨证应该多属“痰、湿、瘀、虚、毒”［7-9］。由此可见，痰湿几乎贯穿了肺癌发生、发展的全过程，因此在肺癌的临床治疗中要重视化痰散结药物的应用。半夏作为临床中常用的理气化痰药，其治疗肺癌的作用机制也值得深入探究。

半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎，味辛、性温，有毒，归肺、脾、胃经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效［10］。现代药理学研究显示，半夏具有镇咳、祛痰止呕、抗肿瘤、抗胃溃疡、凝血、抗菌和抗炎等药理作用［11］。研究发现，半夏提取液可以诱导肿瘤细胞K562凋亡，延长K562细胞G0/G1期，干扰DNA的合成［12］，并且可以有效恢复肿瘤相关树突细胞的未成熟状态，增强其作为抗原呈递细胞的功能，进一步引发抗肿瘤Th1 和CTL 反应［13-14］。此外，有研究发现半夏提取物可以显著增加HPV +TC-1 细胞凋亡和坏死率，阻断细胞周期的进行，进而抑制肿瘤生长和对缺血性坏死的抵抗力［15］，增强机体的免疫功能，并且可以直接对肿瘤细胞进行杀伤［16］，由此可知半夏提取物可能是一种潜在的癌症免疫调节治疗药物。在中晚期肺癌的中药治疗用药规律研究中发现，使用频次最高的是化痰散结药［17］，半夏的使用频率均居前十位［18-23］，但其防治肺癌的作用机制尚不明了。

网络药理学是一种从网络观点出发，以系统水平识别“药物-疾病-基因-靶点”的多分子药物协同作用机制的新型研究策略，其核心思想与中医学的整体观念有一定相通之处，符合对肿瘤等复杂疾病进行系统性治疗的需求［24］。基于此，本研究通过网络药理学，挖掘半夏治疗肺癌的作用靶点，结合生物信息学的优势，探究半夏防治肺癌的有效活性成分、潜在治疗靶点和作用机制，为半夏治疗肺癌提供临床及药理作用研究基础。

1 材料与方法

1.1 半夏活性成分及作用靶点的筛选与收集

在TCMSP 数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索半夏，设定生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 得到半夏活性成分，选择“Re-lated Targets”获取半夏活性成分所有靶点，并通过Uniprot（http：//www.Uniprot.org）数据库获取半夏活性成分对应的人类靶标基因。

1.2 肺癌相关靶点的获取

以“lung cancer”为关键词在DisGeNET（www.disgenet.org）数据库检索肺癌相关基因，检索物种为“Homo sapiens”。

1.3 半夏抗肺癌的潜在作用靶点的获取

通过韦恩图（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将半夏的活性成分潜在靶点和肺癌的相关靶点映射交集，得到交集基因并绘制韦恩图。

1.4 靶标蛋白互作网络（PPI）的构建

将上述半夏抗肺癌的潜在作用靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org）。将下载的文件导入Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析，构建半夏治疗肺癌的靶标蛋白互作（PPI）网络，进一步使用CytoHubba 插件进行网络拓扑分析，参考MCC 值筛选网络中关键靶点。

1.5 GO功能和KEGG信号通路富集分析

分别在Metascape（http：//metascape.org/）平台和HIPLOT 数据库（https：//hiplot.com.cn）平台对核心靶点进行分析，将物种设置为人，进行GO 功能和KEGG信号通路富集分析，设置P＜0.05 为差异有统计学意义，输出结果并绘制气泡图或条形图。

1.6 半夏抗肺癌主要靶点的分子对接

通过PubChem 下载“1.4”项下筛选的半夏抗肺癌的主要活性成分的“SDF”格式，并将其导入“Chem3D 19.0”优化三维结构；从PDB 数据库下载“1.4”项下筛选出的半夏抗肺癌的主要核心靶点蛋白的蛋白质3D结构，并保存pdb 格式。利用AutoDock Tools 对成分和蛋白进行加水、去氢、分离配体和受体等操作，利用AutoDock Vina 计算靶点与配体之间对接活性的分值，得分＜-5.0则结合活性较佳，得分＜-7.0说明两者之间有强烈的对接活性，可作为半夏治疗肺癌作用靶点的筛选依据［25］。

2 结果

2.1 半夏的活性成分及作用靶点

通过TCMSP数据库，检索到半夏化学成分116种，使用OB ≥30%和DL ≥0.18 条件获得包括24-乙基胆碱-4-烯-3-酮、卡维汀、黄芩素、中黄芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、二十碳-11-烯酸和松柏苷等在内的13种活性化合物。见表1。将对应蛋白导入Uniprot数据库，通过筛选共得到97个靶点基因。

表1 筛选后半夏活性成分情况

2.2 肺癌相关靶点的获取

以“lung cancer”为关键词，检索物种为“Homo sapiens”，在DisGeNET数据库进行检索，搜集到肺癌靶点共4 174个。

2.3 半夏抗肺癌的潜在作用靶点的获取

通过韦恩图（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）制作，将半夏97个成分潜在靶点和肺癌4 174个相关靶点映射交集，得到39 个交叉靶点，即半夏治疗肺癌潜在作用靶点。见图1。

图1 肺癌相关基因与半夏活性成分对应靶点韦恩图

2.4 靶标蛋白互作网络（PPI）的构建

将39个潜在作用靶点上传至STRING 数据库进行分析，得到靶标蛋白互作数据关系，利用Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析，构建半夏治疗肺癌的靶标蛋白相互作用网络。见图2。在拓扑网络中包含39 个节点，240 条边，平均节点度为12.3，平均局部聚类系数为0.725。进一步利用CytoHubba 插件对网络进行拓扑分析，根据MCC 值筛选网络中的关键靶点，根据MCC 值取前10 个关键靶点，从大到小排列，分别是抑癌基因p53（Tumor Protein P53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RAC-α（Serine/threonine proteinase RAC- α，AKT1）、缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、转录因子AP-1（Transcription Factor AP-1，JUN）、血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Cysteine-containing aspartate-specific proteases3，CASP3）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9（Cysteine-containing aspartate-specific proteases9，CASP9）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（Cysteine-containing aspartatespecific proteases8，CASP8）和细胞周期蛋白B1（Cyclin B1，CCNB1）。这些靶点可能是半夏治疗肺癌的重要靶点。见表2和图3。

表2 关键靶点TOP 10（根据MCC分值）

图2 半夏抗肺癌靶标蛋白相互作用网络

图3 关键靶点TOP 10

2.5 GO功能和KEGG信号通路富集分析

将39 个核心靶点导入HIPLOT 数据库（https：//hiplot.com.cn）进行GO 功能富集分析，按照P＜0.05进行筛选，分析P值排名前10 名结果，涉及的生物过程（biological process，BP）主要包括对金属离子的反应、氧化应激反应、活性氧（reactive oxygen species，ROS）反应、细胞对化学应激的反应、对有毒物质的反应、缺氧反应、对氧水平降低的反应、对氧水平的反应、肽基丝氨酸磷酸化和细胞对氧化应激的反应。见图4。分子功能（molecular function，MF）主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、蛋白激酶调节活性、激酶调节活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、组蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶2A（PP2A）结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶激活剂活性、细胞周期素依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性和过氧化物酶活性。见图5。细胞组分（cellular component，CC）主要涉及膜筏、膜微区、膜区、转移酶复合物，转移含磷基团、分泌颗粒腔、细胞周期素依赖性蛋白激酶全酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白激酶复合物、髓鞘和血小板α 颗粒腔。见图6。

图4 半夏抗肺癌潜在靶点的GO-BP富集分析

图5 半夏抗肺癌潜在靶点的GO-MF富集分析

图6 半夏抗肺癌潜在靶点的GO-CC富集分析

将39 个核心靶点导入至Metascape 平台进行KEGG 通路富集分析，按照P＜0.05 进行筛选，取Metascape 平台分析P值排名前12名的结果，分别为癌症通路、乙型肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒感染（EB 病毒感染）、流体剪切应力和动脉粥样硬化、肿瘤蛋白多糖、内分泌抵抗、PI3K/Akt 信号通路（PI3K/Akt signaling pathway）、癌症的MicroRNAs（miRNAs）、脂肪细胞脂解作用的调控、NOD 样信号通路、肿瘤转录因子的转录调控和化学致癌作用。见图7。

图7 半夏抗肺癌潜在靶点的KEGG通路富集

2.6 半夏抗肺癌主要靶点的分子对接

选取核心成分中排名靠前的黄芩素与核心蛋白TP53、AKT1、HIF-1α、VEGFA 进行分子对接，得分均＜-5.0，说明两者之间有良好的对接活性，可作为半夏治疗肺癌作用靶点的筛选依据。见图8、表3。

表3 黄芩素与核心靶点分子对接得分

图8 半夏抗肺癌核心成分与靶点分子对接图

3 结论

通过TCMSP 数据库检索可知，半夏的主要活性成分主要有黄芩素、β-谷甾醇和豆甾醇等。黄芩素可以通过逆转Src 的高磷酸化，抑制Id1 蛋白表达，消除上皮间质转化和血管生成，从而抑制非小细胞肺癌生长及增殖［26-27］。研究发现，黄芩素可以抑制人非小细胞肺癌H460 细胞系中12-LOX 基因和蛋白的表达，诱导人非小细胞肺癌H460 细胞凋亡［28］。黄芩素还可以通过下调miR-424-3p 和靶向PTEN/PI3K/Akt 通路来诱导细胞周期停滞、凋亡并增加对A549 和H460细胞的顺铂敏感性，且有良好的安全性［29-30］。β-谷甾醇可以通过阻滞肺癌A549细胞周期于G2/M 期来抑制细胞增殖，同时促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用［31］。有体外实验发现，豆甾醇可以抑制卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、胆囊癌、胃癌和皮肤癌等多种肿瘤细胞，其机制涉及降低PI3K/Akt 信号通路的蛋白质和mRNA 表达、上调凋亡基因的表达、诱导细胞周期阻滞以及破坏肿瘤血管的生成等［32-33］，但是尚无涉及肺癌的相关实验。由此可知，半夏的这些活性成分与肿瘤的发生、发展紧密相关，在肺癌的治疗中发挥着复杂的作用，为半夏抗癌的研究提供了可靠依据。

通过分析靶标蛋白互作网络，TP53、AKTI、HIF-1α 和VEGFA 处于网络的核心地位，可视为半夏治疗肺癌的关键靶点。TP53是编码肿瘤蛋白p53的抑癌基因，位于17号染色体短臂（17p13），外显子5-8是人类肿瘤突变的热点区［34］。TP53 基因突变可以引起抑癌功能丧失、干扰p53相关蛋白、耐药基因上调、Axl酪氨酸激酶受体过度表达等，导致间质和上皮性肿瘤出现早期发病的倾向［35］。有研究发现TP53 基因突变几乎发生在所有的小细胞肺癌中，该基因在非小细胞肺癌中也是常见的突变基因，可以作为非小细胞肺癌疗效和预后的生物标志物［36-38］。蛋白激酶B（AKT）在人类癌症中最常因上游调节因子的突变而激活［39］，其中AKT1 突变是硬化性肺细胞瘤的遗传标志［40］。AKT1蛋白的表达参与了肺癌的发展及转移［41］。HIF-1 可调控约200 种靶基因的表达水平，其机制有调节肿瘤细胞的缺氧适应、血管形成、细胞活性、细胞代谢和增殖转移等［42］。HIF-1α 受硫化氢调控，能够调节非小细胞肺癌上皮-间充质转化和血管生成［43］，在肺癌的发生、转移、评估和预后中起重要作用［44］。VEGFA 是肺癌血管生成的关键因素，可通过介导内皮细胞增殖，增加血管通透性，促进肿瘤细胞的生长和转移［45-46］，与肺癌组织的临床分期、组织分化和淋巴转移密切相关［47-48］。

通过GO 功能富集分析，发现半夏治疗肺癌的潜在靶点参与了多项生物过程，其中ROS 反应、PP2A 结合、氧化应激反应涉及靶点较多，度值较高。ROS是一类在细胞正常代谢过程中产生的具有强氧化性的小分子化学物质［49］，适量的ROS 能够促进肿瘤细胞增殖和分化，过多则又会导致细胞内氧化应激增强，而造成脂质、蛋白质和DNA 的氧化损伤，最终导致肿瘤细胞的凋亡或坏死［50-51］。ROS 代谢功能的增高程度不同，对于肿瘤发生、发展的结局也截然不同，所以合理调控ROS，使其在肿瘤治疗中发挥积极作用就变得十分重要。PP2A 主要是指丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，它是一种重要的肿瘤抑制蛋白，可以通过A、B、C 三种亚基的突变、缺失、失活和异常表达调节许多致癌信号通路［52-53］。氧化应激是ROS的产生与抗氧化剂的效率之间平衡紊乱的状态［54］，可导致基因表达、细胞增殖和细胞凋亡的变化，并在肿瘤的发生和发展中起重要作用［55-57］。这些均表明半夏可能是通过调节细胞对能量代谢、信号通路、蛋白活性和基因表达等多个生物过程与分子功能，从而发挥治疗肺癌的作用。

在KEGG 信号通路富集分析中发现，半夏在治疗肺癌的过程中主要涉及癌症通路、肿瘤蛋白多糖、PI3K/Akt 信号通路、癌症的miRNAs、癌症中的转录失调及化学致癌等多个信号通路，这些通路都与肺癌的发生和发展密切相关。研究发现通过下调PI3K/Akt信号通路的蛋白表达可以抑制非小细胞肺癌A549 细胞生长，并促进其凋亡，进而降低肿瘤标志物水平［58-60］。PI3K/Akt 信号通路还发挥着免疫调节剂的关键作用，通过联合使用免疫调节剂抑制PI3K/Akt 信号通路可以为肿瘤的治疗提供新的途径［61］。miRNAs 参与了肿瘤细胞生长、分化、增殖、凋亡及侵袭等重要生物学行为。有研究发现，以血源性miRNA 为特征进行液体活检检测肺癌具有较高的准确性、敏感性和特异性，提示血源性miRNA 作为潜在循环标志物或许可以作为影像学、痰细胞学和活检的补充，用于肺癌的检测［62］。另有研究发现，不同亚型miRNAs 在肺癌化疗抵抗中发挥不同的作用，如miR-21 可以下调PTEN表达促进非小细胞肺癌细胞耐药，miR-539 过度表达可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等作用增强耐药非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性［63］。肿瘤患者化疗耐药时间的长短与患者的生存时间密切相关，而不同miRNAs会对肺癌的治疗有不同的作用，如何通过调控miRNAs 发挥其在肺癌化疗中减毒增效的作用及具体的作用机制值得进一步探究。以上富集分析显示，半夏活性成分的潜在靶点分布于多个生物过程及信号通路，这些有效成分协同发挥着防治肺癌的作用。

本研究通过挖掘开放数据库中丰富的实验和临床资料，利用网络药理学及分子对接技术探究半夏治疗肺癌的作用机制，发现其可以通过多活性成分、多靶点和多信号通路对肺癌的进行干预，这为今后半夏治疗肺癌的药理研究及临床应用提供了理论依据及新思路。但网络药理学的预测分析仍存在一定不足，如数据库的准确性和全面性不完善、数据更新相对滞后、未涉及到半夏的种类、临床用药剂量、药物之间相互作用等对肺癌治疗的影响，未来可以利用细胞分子生物学和免疫学等实验手段进一步验证，以便深入研究半夏防治肺癌的作用机制。