温度调控线粒体自噬活性影响再灌注损伤合并脓毒症大鼠心肌功能的实验研究

陈辰博，赵吉锐，唐美秀，刘建和，，李 亮

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)现象在临床较为常见，理论上缺血区域的血供可恢复，但引发的心肌缺血/再灌注损伤可继发性导致急性心力衰竭、脑功能障碍、胃肠功能障碍、全身炎症反应综合征[1-2]。重者出现多器官功能障碍综合征，危及病人生命，因此，心肌缺血/再灌注损伤研究一直为基础和临床研究的热点。心肌缺血/再灌注损伤伴发脓毒症病人因全身炎性反应综合征被激发，心脏发生不可逆的功能障碍且进行性加重，治疗难度相对较大，采取科学、规范的方法维持再灌注能有效改善心肌功能，降低临床病死率[3]。检索国内外研究，关于再灌注条件参数设置的研究相对较多，但关于再灌注温度调控对心肌影响机制的论述偏少[4-5]。本研究探讨温度调控线粒体自噬活性，继而影响心肌缺血/再灌注合并脓毒症大鼠的内在机制，为再灌注相关技术及条件设置提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠45只，体质量253～287 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证编号：SYXK湘2021-0003)。饲养环境：温度20～25 ℃，湿度50%～55%，昼/夜交替(均为12 h)，自由饮水和进食，适应性喂养7 d开始实验。分为健康组(9只)和模型组(36只)，健康组正常饲养，模型组先后制作脓毒症模型和心肌缺血模型。本动物实验遵循相关规定，在长沙医学院重点实验室备案。

1.2 试剂仪器

1.2.1 主要试剂 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)分析试剂盒[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]；白细胞介素-1β(IL-1β)的酶联免疫吸附试验法(ELISA)定量检测试剂盒[Abcam 公司、沃卡威(北京)生物技术有限公司]；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(上海乔羽生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)活力检测试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)；血管内皮生长因子(VEGF)测定试剂盒(深圳市科润达生物工程有限公司)；血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)和半胱天冬氨酸蛋白酶-2(Caspase-2)ELISA检测试剂盒购自上海沪震生物科技有限公司；IκB激酶β(IKKβ)测定试剂盒(上海梵态生物科技有限公司)；Na+-K+-ATP酶ELISA试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)ELISA试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)；辅酶Q细胞色素C还原酶ELISA试剂盒[今品化学技术(上海)有限公司]；NADH-辅酶Q还原酶ELISA试剂盒[卡迈舒(上海)生物科技有限公司]；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法测定试剂盒[上海碧云天生物技术有限公司]等。

1.2.2 主要仪器 HH-s4型水浴锅(济南欧莱博科学仪器有限公司)；FA型电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)；BYG16型高速离心机(长沙湘锐离心机有限公司)；M401542型全自动生化检测仪(北京普朗新技术有限公司)；JD-SY96S型酶标仪(山东竞道光电科技有限公司生产)；FKW型医用控温仪(南京贝登医疗股份有限公司)等。

1.3 造模方法 先制作脓毒症模型，而后制作心肌缺血模型，造模过程中2只大鼠意外死亡通过递补机制进行补充。

1.3.1 脓毒症造模方法 大鼠腹腔注射脂多糖10 mg/kg，每天3次。12 h内出现蜷缩、少动、倦怠、少食、腹泻、眼角渗出内容物等典型症状则造模成功[6]。

1.3.2 心肌缺血造模方法 禁食10 h，固定于手术台上并连接生物功能实验系统，腹腔注射4%戊巴比妥钠50 mL/kg进行麻醉，颈部备皮并用75%乙醇消毒。于颈部造2 cm切口，钝性分离右侧颈前肌和胸锁乳突肌后暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，手术线结扎颈总动脉近心端，血管夹对颈外动脉和颈内动脉进行暂时性夹闭(关闭10 s，开放10 s，循环120 s)。大鼠心前区较其他未缺血心肌变灰白则造模成功[7]。

1.4 分组及干预方法

1.4.1 分组方法 采用随机数字表将模型组大鼠分为低温组、亚低温组、常温组、高温组，每组9只。其中，低温组再灌注温度为(5±1)℃，亚低温组再灌注温度为(32±1)℃，常温组再灌注温度为(36±1)℃，高温组再灌注温度为(39±1)℃[8]。

1.4.2 再灌注操作 大鼠连接动物呼吸机，调整呼吸频率为75次/min，呼吸比为1∶1，潮气量为11.5 mL/100 g。用血管钳剥离大鼠第三肋、第四肋间肌，再用开胸器扩张两侧肋骨，露出心脏。小心撕去心包膜，于左前降支缓慢进针，迅速结扎血管后出针，待缺血30 min剪开结扎，设置(5±1)℃、(32±1)℃、(36±1)℃、(39±1)℃的生理盐水分别对4组大鼠进行再灌注30 min，密切关注大鼠生命体征情况[9-10]。

1.5 检测指标

1.5.1 特征生化指标和特征蛋白 MDA、SOD、IL-1β、CK-MB、LDH、血管内皮生长因子A(VEGFA)蛋白、AngⅠ蛋白、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量参照各试剂盒说明书进行检测。

1.5.2 心肌细胞线粒体呼吸链相关酶 ①心肌细胞线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性检测采取定磷法，通过无机磷在反应中的释放量来测定心肌组织内ATP含量(以单位时间内每克蛋白释放ATP所需的无机磷量表示)，按ATP酶检测试剂盒说明书操作，酶标仪测定OD值[11]。②心肌细胞线粒体呼吸链酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性采用BCA法测定：预先调整各样品蛋白浓度保持一致，按ELISA 试剂盒说明书操作，用酶标仪测定各孔OD值(λ=450 nm)，绘制标准曲线并按曲线方程计算结果[12]。

2 结 果

2.1 健康组和模型组大鼠心肌组织各指标含量比较 模型组大鼠MDA、IL-1β、CK-MB、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量高于健康组，SOD、VEGFA蛋白、AngⅠ蛋白含量低于健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、呼吸链酶Ⅰ、呼吸链酶Ⅱ、呼吸链酶Ⅲ含量低于健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1～表3。

表1 健康组和模型组大鼠心肌组织特征生化指标含量比较(±s)

表2 健康组和模型组大鼠心肌组织特征蛋白含量比较(±s)

表3 健康组和模型组大鼠心肌细胞线粒体呼吸链相关酶含量比较(±s)

2.2 不同灌注温度组大鼠心肌组织各指标含量比较 亚低温组大鼠MDA、IL-1β、CK-MB、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量低于低温组、常温组、高温组，SOD、VEGFA、AngⅠ蛋白含量高于低温组、常温组、高温组，差异均有统计学意义(P<0.05)；亚低温组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、呼链酶Ⅰ、呼吸链酶Ⅱ含量高于低温组、常温组、高温组，呼吸链酶Ⅲ含量低于低温组、常温组、高温组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4～表6。

表4 不同灌注温度组心肌组织特征生化指标含量比较(±s)

表5 不同灌注温度组心肌组织特征蛋白含量比较(±s)

表6 不同灌注温度组心肌细胞线粒体呼吸链相关酶含量比较(±s)

3 讨 论

心肌缺血/再灌注是在多种疾病状态下发生的病理事件，能导致有害的细胞损伤[13]。缺血是指器官的血液供应受限，其与细胞代谢失衡和有害缺氧有关。再灌注能够恢复受影响缺血区域的血流和再充氧，这会进一步导致组织过度退化，引发破坏性炎症反应[14-15]。心肌缺血/再灌注期间心肌膜完整性丧失，心肌酶CK-MB、LDH释放到血液中。因此，血清CK-MB和LDH水平作为心肌组织损伤的指标[16]。本研究结果显示，模型组MDA、CK-MB高于健康组，而SOD低于健康组(P<0.05)，证实心肌缺血/再灌注合并脓毒症模型大鼠造模成功，其血清多项炎症、应激指标的表达水平均有明显改变。亚低温组MDA、CK-MB、SOD表达水平均优于其他组别，证实大鼠进行再灌注操作时保持适当低温有助于缓解心肌细胞局部应激反应。可能与病态下大鼠不能适应绝对低、高温而会继发性损害原有损伤的心脏组织，常温灌注则不会减缓内毒素侵袭心肌组织有关[17-18]。可用组织氧和营养物质的突然减少是引发缺血组织细胞损伤的关键，在缺血条件下，线粒体从有氧代谢转变为无氧代谢，随后导致ATP减少并伴随组织酸化，ATP生成的抑制引发细胞内钠和细胞外钾水平的升高，从而使细胞去极化，并导致补偿性瞬时钙内流[19]。同时，钙依赖性蛋白水解酶被激活，导致细胞凋亡和坏死[20]。此外，在这种细胞级联反应中，其他重要的ATP依赖性细胞功能，例如磷酸化和酶活性，也受到抑制，导致细胞应激和细胞死亡级联反应，在正常的非缺血生理条件下，几种内源性机制负责清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)[21]。研究表明，缺血组织的再灌注会导致活性氧的“爆发”，而这种氧化爆发可以介导缺血/再灌注损伤[22]。还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶家族的线粒体呼吸链和NADPH氧化酶被认为是ROS的重要来源，内源性或外源性抗氧化剂已被证明可以保护肝脏、肾脏、心脏和大脑免受缺血/再灌注损伤[23]。本研究结果显示，模型组5种心肌细胞线粒体呼吸链相关酶含量均低于健康组，且亚低温组大鼠各指标含量均高于其他温度组，表明低温对缺血心肌组织灌注具有保护作用，这可能是低温生理盐水能快速降低心肌温度，减轻心肌组织损伤。线粒体通透性的特征在于相对不可渗透的线粒体内膜的透化[23]。在再灌注期间，细胞的命运由线粒体透化程度决定，如果线粒体透化程度较小，则细胞可能会恢复；如果线粒体透化程度中等，细胞可能会经历程序性细胞死亡；如果线粒体透化程度严重，细胞可能会因能量产生不足而坏死[24]。

缺血和再灌注过程中的细胞内变化，如H+和Ca2+的积累以及线粒体膜电位的破坏，导致自由基或活性氧的形成。产生的炎性小体包括不同的衔接分子，可介导IL-1β的产生和分泌增加[20-21]。研究表明，糖尿病心肌缺血/再灌注后，心肌的氧化应激因子SOD水平降低，而MDA水平升高，产生过多的活性氧，加剧了心肌损伤的发展[25]。在本研究中，模型组大鼠MDA、IL-1β含量明显高于健康组大鼠，SOD含量明显低于健康组大鼠(P<0.05)。亚低温组大鼠MDA、IL-1β含量明显低于其他温度组大鼠，SOD含量明显高于其他温度组大鼠(P<0.05)，表明低温处理可以减轻缺血再灌注损伤合并脓毒症中的氧化应激程度。

脓毒症最严重的临床症状是感染性休克，表现为血管扩张和心肌功能障碍。脓毒症心肌功能障碍的发生与死亡率密切相关[6，11]。研究表明，VEGFA和AngⅠ可通过调节细胞增殖、抑制细胞凋亡和减少氧自由基的释放而对心肌缺血/再灌注发挥心脏保护作用[23]。Caspase-2在使线粒体透化和启动促凋亡线粒体蛋白释放方面具有明显的上游作用[24]。IKKβ能够介导核转录因子-κB(NF-κB)活化[25]。NF-κB信号通路是机体内一条重要的炎性调节通路，在脓毒症时处于激活状态[26]。在本研究中，模型组大鼠VEGFA、AngⅠ蛋白含量明显低于健康组大鼠，Caspase-2、IKKβ蛋白含量明显高于健康组大鼠(P<0.05)，且亚低温组大鼠VEGFA、AngⅠ蛋白含量明显高于其他温度组大鼠，Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量明显低于其他温度组大鼠(P<0.05)，表明低温处理可能对缺血再灌注损伤合并脓毒症大鼠具有心脏保护作用。这可能是VEGFA通过促进血管内皮细胞的增殖和迁移而直接作用于血管内皮细胞。AngⅠ与腺嘌呤核苷酸转运体结合，增加线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放阈值，从而抑制mPTP开放，保护线粒体膜的完整性[27]。

本研究动物为再灌注损伤合并脓毒症大鼠，其病态能较好反映病症复杂的临床病人，通过与健康组比较也可深入了解疾病对其机能的严重影响；比较不同温度灌注病态大鼠引发影响的差别，可为临床实践提供参考依据；分析温度调控心肌细胞线粒体自噬活性，继而影响心肌功能的内在机制，可为再灌注手术操作的参数设定及后续探索积累一定理论基础。但本研究尚未对信号通路、特定基因进行检测，其机制探索仍相对局限，后续研究需在此基础上加以完善。