基于网络药理学和分子对接技术探讨人参、丹参、葶苈子治疗慢性心力衰竭的分子机制

黎燚华，陈 琦，康 亮，张志敏，赵新军，李 荣

慢性心力衰竭是指心脏结构和/或功能的异常，使心室收缩和/或舒张功能发生障碍，从而引起的一组复杂临床综合征。现代医学在心力衰竭治疗中常用的药物包括强心剂、利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂等。强心剂与利尿剂可改善病人血流动力学，快速改善心力衰竭症状。ACEI/ARB、β受体阻滞剂及醛固酮受体拮抗剂可以抑制心室重构，延缓心力衰竭进展[1]，被称为治疗心力衰竭的“金三角”药物。尽管如此，心力衰竭易损期的死亡率和再入院率仍旧居高不下，是目前心血管领域亟待攻克的难题。

越来越多研究表明，中医药在治疗心力衰竭的过程中可发挥网络作用，具有多靶点、多通路的特点。中医认为，心为“君主之官”“主身之血脉”，若诸类病因影响及心，致心气虚弱，心气虚则其行血功能下降，气不行血，血行不畅则致血瘀。血瘀会导致机体各部分受精气充养减少而出现功能异常。当肺、脾、肾等主管机体水液代谢的脏腑出现功能失调时，则出现水液不化，产生水饮之邪留于体内。瘀和水是心力衰竭最常见的病理产物，两者同属阴邪，瘀水互结，易进一步损伤心气，最终损及心阳、心阴，气血衰败，发展为心力衰竭。由此可见，心力衰竭的病机为本虚标实，本虚包括心气虚、心阳虚、心阴虚，标实多为血瘀、水停。标本俱病，虚实夹杂。心气虚是心力衰竭发病的始动环节，血瘀、水停为最常见的病理产物，同时又可作为致病因素进一步损伤心气，形成恶性循环[2]。

心力衰竭的治疗关键在于截断病机中的恶性循环，此过程中的中医治疗需遵循“补虚泻实”的原则。针对心力衰竭“虚”“瘀”“水”三位一体的本虚标实病机，广州中医药大学第一附属医院心血管科李荣教授提出，在心力衰竭的治疗中当标本同治，善用补气、活血、利水三大法则，以“补气药、活血药、利水药”构建中医治疗心力衰竭的“药物金三角”[3]。李荣教授认为，补气可补充心脏动力、恢复心脏正气、提升心脏功能，是保障心主血脉的功能正常发挥的基础。同时兼以活血、利水之法，前者是截断心力衰竭病机中不良循环的关键，后者则是祛除病理产物的重要手段。众多临床研究表明，中医“药物金三角”对于心力衰竭具有显著疗效，但其中的分子机制尚未被阐明。因此，本研究利用网络药理学及分子对接技术，基于中医“药物金三角”的代表性药物人参、丹参、葶苈子，探讨其治疗心力衰竭的分子机制。

1 资料与方法

1.1 中医“药物金三角”成分搜集与靶点预测 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[4]数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索人参、丹参、葶苈子的化学成分，并利用该数据库推荐的口服生物利用度(OB)≥20%和类药性(DL)≥0.1进行潜在活性成分的筛选。随后下载筛选后的潜在活性成分的＊.mol2格式3D结构文件，利用Open Babel 3.1.1软件将＊.mol2文件转换为简化分子线性输入规范(simplified molecular input line entry system，SMILES)。接着利用SEA[5]数据库(https://sea.bkslab.org/)和HITPICK[6]数据库(http://mips.helmholtz-muenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=targetPrediction.html)对潜在活性成分进行靶点预测。

1.2 心力衰竭致病基因搜集 分别利用“heart failure”“congestive heart failure”和“chronic heart failure”作为检索词在GeneCards[7]数据库(https://www.genecards.org/)、CTD[8]数据库(http://ctdbase.org/)和DrugBank[9]数据库(https://go.drugbank.com/)检索并获取心力衰竭的致病基因，对其结果进行整合。

1.3 药物对心力衰竭作用靶点的筛选 利用在线韦恩图工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取所有药物与心力衰竭的作用靶点，将其命名为“映射靶点”。随后分别获取补气药、活血药和利水药与心力衰竭的作用靶点。

1.4 映射靶点的蛋白互作分析及网络构建 利用STRING[10]数据库(https://string-db.org/)对药物作用于心力衰竭的靶点进行蛋白-蛋白互作(PPI)分析，并利用Cytoscape 3.7.2软件[11]对PPI关系进行可视化分析和网络拓扑学分析。

1.5 药物对心力衰竭作用靶点的富集分析 将药物对心力衰竭的作用靶点提交至STRING网站中进行富集分析，包括基因本体(GO)的生物过程富集分析(GO-BP)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析，使用Cytoscape 3.7.2软件构建“成分-靶点-通路”网络。

1.6 分子对接分析 从PDB[12]数据库中获取受体蛋白的＊.pdb格式3D结构文件，利用ADT软件对蛋白进行去除水分子、加极性氢、计算电荷、确定对接口袋，并输出为＊.pdbqt格式文件，作为分子对接的受体库。使用Raccoon软件[13]对潜在活性成分的＊.mol2格式3D结构文件进行批量预处理，输出保存为＊.pdbqt格式文件，作为分子对接的配体库。随后使用Autodock Vina[14]对受体及配体进行半柔性对接。

2 结 果

2.1 药物成分 在TCMSP数据库中共检索获得人参成分190个、丹参成分202个、葶苈子成分68个，经过OB及DL筛选，共获得药物潜在活性成分187个，其中人参潜在活性成分66个，丹参潜在活性成分97个，葶苈子潜在活性成分24个。部分潜在活性成分及其参数见表1。

表1 部分潜在活性成分的相关信息

2.2 药物靶点及心力衰竭致病基因 经过SEA及HITPICK数据库预测，共获得药物对应靶点455个，其中人参靶点341个，丹参靶点287个，葶苈子靶点264个。另外，从GeneCards、DrugBank、CTD数据库中共获得心力衰竭致病基因710个。通过构建韦恩图，发现人参、丹参、葶苈子分别通过69个、63个和61个靶点作用于心力衰竭。经过去重，发现这3种药物共通过97个靶点作用于心力衰竭，这97个靶点被定义为映射靶点。利用STRING网站对映射靶点进行PPI网络分析，随后利用Cytoscape 3.7.2对结果进行拓扑分析以获取节点的度值(Degree)。节点在网络中越重要，则节点的Degree越大。该网络中共包含87个靶点、598个相互作用关系，平均度值为6.87。其中肿瘤坏死因子(TNF，Degree=26)、血管内皮生长因子 A(VEGFA，Degree=24)、信号转导和转录激活因子3(STAT3，Degree=23)、丝裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8，Degree=22)、清蛋白(ALB，Degree=22)等靶点是映射靶点中的关键靶点。详见图1。

图1 映射靶点PPI网络图

2.3 富集分析

2.3.1 映射靶点 利用在线网站STRING对映射靶点进行GO-BP和KEGG富集分析。结果显示，映射靶点共富集到GO-BP条目1 116条、KEGG条目144条。其中，排名前30位的GO-BP及KEGG条目见图2、图3。可见，人参、丹参、葶苈子在治疗心力衰竭时涉及对化学物质的反应(GO：0042221)、对药物的反应(GO：0042493)、炎症应答(GO：0006954)、对外部刺激的反应(GO：0009605)、对激素的反应(GO：0009725)等主要的生物过程以及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路(hsa04933)、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路(hsa04024)、胰岛素抵抗(hsa04931)、白介素-17信号通路(hsa04657)、Toll样受体信号通路(hsa04620)等关键通路。

图2 映射靶点GO-BP通路富集分析(前30位)

图3 映射靶点KEGG通路富集分析(前30位)

2.3.2 人参、丹参、葶苈子靶点 为了探讨补气、活血、利水药物在治疗心力衰竭中的异同，对3类药物作用于心力衰竭的靶点分别进行了KEGG通路富集分析。结果显示，人参、丹参、葶苈子作用于心力衰竭的靶点富集所得KEGG通路条目的数量分别为83个、107个和94个。利用韦恩图对3类药物的KEGG通路条目进行分析，发现3类药物在治疗心力衰竭时涉及了共同的通路，同时3类药物具有各自独特的通路。详见图4。

图4 中医“药物金三角”作用于心力衰竭的靶点的KEGG通路分析

其中，3类药物共有的关键KEGG通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(hsa04933)、cAMP信号通路(hsa04024)、Toll样受体信号通路(hsa04620)、白介素-17信号通路(hsa04657)等；人参独有的关键通路有凋亡-多个物种(hsa04215)、皮质醇的合成和分泌(hsa04927)等；丹参独有的关键通路包括Rap1信号通路(hsa04015)、肌动蛋白细胞骨架的调节(hsa04810)、酪氨酸激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT)信号通路(hsa04630)等；葶苈子独有的关键通路包括心肌收缩(hsa04260)、心肌细胞中的肾上腺素能信号(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)等；此外，在人参与葶苈子共有的通路中包括NOD样受体信号通路(hsa04621)、醛固酮调节的钠重吸收(hsa04960)、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路(hsa04022)等。这些通路都与心力衰竭的发生发展具有密切关系。

2.4 “成分-靶点-通路”网络的构建 以“heart failure”为检索词，在MalaCards[15]数据库(https://www.malacards.org/)中检索与心力衰竭相关的通路，共获得与心力衰竭密切相关的13个信号通路，其中包含了前面获得的5个信号通路，分别为cAMP信号通路(hsa04024)、心肌收缩(hsa04260)、心肌细胞中的肾上腺素能信号(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)、cGMP-PKG信号通路(hsa04022)。这5个信号通路中共包括14个靶点，对应于52个潜在活性成分。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-通路”网络，详见图5。通路之间通过1个或多个靶点形成相互联系，而1个靶点又可对应于来自不同药物的多个活性成分。因此，中医“金三角药物”可以通过多成分对应多靶点，对多个心力衰竭的重要通路产生影响，形成一个复杂网络关系，从而发挥治疗作用。

图5 “成分-靶点-通路”网络

2.5 分子对接分析 为了探讨“成分-靶点-通路”网络中靶点与潜在活性成分的作用关系，选取人参、丹参、葶苈子的共同靶点(ABCC4、NFKB1、PPARA)与52个潜在活性成分进行半柔性分子对接。

2.5.1 对接相关信息 由于PDB数据库中无ABCC4相关信息，故使用SWISS-MODEL[16]数据库(https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模以获取ABCC4的3D结构文件。随后利用PROTEINS PLUS[17]网站(https://proteins.plus/)进行口袋预测以获取对接口袋。详见表2。

表2 受体基本信息与对接口袋数据

2.5.2 分子对接结果 分子对接结果显示，NFKB1、PPARA、ABCC4与52个潜在活性成分的结合能均小于0，最高为-15.062 kJ/mol，最低为-41.422 kJ/mol，总平均结合能为-29.246 kJ/mol。NFKB1、PPARA、ABCC4与潜在活性成分的平均结合能分别为-24.267 kJ/mol、-30.543 kJ/mol和-33.054 kJ/mol。另一方面，与3个受体结合最好的潜在活性成分为蝙蝠葛碱(MOL001965)、丹酚酸J(MOL007142)、异丹参酮Ⅱ(MOL007111)、茯苓甾醇(MOL001659)、吴茱萸苷(MOL003909)等。详见表3。

表3 分子对接结果

3 讨 论

本研究使用网络药理学方法及分子对接技术，对中医“药物金三角”治疗心力衰竭的分子机制进行了阐释。研究结果表明，中医“药物金三角”的代表药物人参、丹参、葶苈子可通过97个靶点作用于心力衰竭，其中TNF、VEGFA、STAT3、MAPK8、ALB等为关键靶点。相关研究表明，慢性过表达TNF会引起心肌肥厚、心肌细胞凋亡、心脏射血分数降低等，促进心力衰竭发展[18]。VEGFA参与心血管的形成、内皮细胞的迁移与活化等，在失代偿心力衰竭的心脏中，可观察到VEGFA的表达降低，提示VEGFA是心力衰竭的一个潜在治疗靶点[19]。STAT3对于维持心脏的正常功能具有重要作用，内源性正常水平的STAT3可减轻心脏肥大，但STAT3在心肌细胞中过表达或缺失都会引起心肌肥厚及心脏纤维化，促进心力衰竭的发展[20]。MAPK8是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的成员，是血管紧张素Ⅱ以及肾上腺素能激动剂促进心肌细胞肥大过程的重要机制[21]。ALB是调节血浆胶体渗透压的关键物质，同时还是外源性药物的在体蛋白，其水平对于心力衰竭转归具有优良的预测价值[22]。GO-BP表明，映射靶点参与机体对化学物质的反应、对药物的反应、炎症应答、对外部刺激的反应、对激素的反应等生物过程。

此外，本研究还从通路层面阐述了中医“药物金三角”治疗心力衰竭的机制。通路富集分析表明，cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、心肌收缩、心肌细胞中的肾上腺素能信号、醛固酮的合成和分泌是中医“药物金三角”治疗心力衰竭的关键信号通路。cAMP与cGMP属于第二信使，是心脏功能的重要调节因子，cAMP是由儿茶酚胺刺激G蛋白偶联受体的腺苷酸环化酶而产生的，可通过下游的蛋白激酶A(PKA)调节心脏收缩与舒张的强度和频率。cGMP是在鸟苷环化酶受到一氧化氮和利钠肽的作用后产生的，可通过激活其下游效应蛋白激酶G和环核苷酸门控通道调节心脏收缩力和代谢反应[23]。cAMP与cGMP在功能上常常表现出对心脏的相反作用，且两者之间存在密切的相互调节。此外，研究表明，cAMP信号通路在心力衰竭发展过程中具有抑制心肌肥厚的作用[24]。cGMP可作为利钠肽物质的第二信使，可调节心肌收缩力、发挥排钠利尿的作用，还可减弱儿茶酚胺类物质对心脏的刺激作用，抑制心肌重构[25]。在人类的心脏上，β1受体是主要的肾上腺素能受体，当其被激动时可使心脏产生正性变时和正性变力效应，这是心力衰竭初期心脏代偿的重要途径。但长期、慢性的β1受体激动对心脏是有害的，可诱导心肌肥大甚至细胞凋亡。由肾上腺皮质分泌的醛固酮具有保钠保水的作用，与肾素、血管紧张素构成肾素-血管紧张素-醛固酮系统，在心力衰竭初期可通过增加心脏后负荷而保证相对稳定的心输出量，但长期的醛固酮水平增加会启动心肌肥大和间质纤维化的病理过程[26]。分子对接结果表明，这些关键通路中的靶点与药物潜在的活性成分具有良好的结合活性，佐证了中医“药物金三角”可通过干预这些重要靶点与关键通路，发挥治疗心力衰竭的作用。

综上所述，中医“药物金三角”治疗心力衰竭涉及了多成分、多靶点、多通路，以复杂网络的形式调控心力衰竭时心肌收缩、心脏负荷、心室重构等生理病理过程，这为进一步的研究提供了方向。