有氧运动对TNFAIP3介导的NF-κB抑制磷酸诱导血管钙化的影响

王 梦，陈 芳，万 玉，柏中喜

心血管疾病是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)病人发病和死亡的主要原因[1]。CKD中的血管疾病涉及动脉壁的内膜层损伤、内皮功能障碍和脂质代谢障碍，中间层的损伤涉及矿物质代谢紊乱并导致血管钙化，这些因素会导致动脉粥样硬化[2]。此外，这两种血管疾病有一些共同的病因，如炎症、尿毒症毒素和氧化应激。CKD病人的心血管死亡率与内侧血管钙化相关。血管钙化在CKD早期发展，并在疾病晚期逐渐增加[3]。血管钙化是CKD矿物质骨病的一部分，与高磷血症有关，是血管钙化和心血管死亡的危险因素，尤其在CKD病人中[4]。因此，磷酸盐被认为是一种血管钙化发展的关键因素。血管钙化被认为是一个活跃的过程，主要由血管平滑肌细胞调节[5]。在高磷刺激期间，血管平滑肌细胞分化为具有成骨/成软骨细胞表型的细胞。血管钙化是一种机制复杂的生物调节过程，可由肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)/核转录因子-κB(NF-κB)/半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)信号通路介导[6]。据报道，TNFAIP3表达的上调对抗钙化作用至关重要。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反过来通过负反馈机制抑制NF-κB活性[7]。定期有氧运动被广泛认为是降低心血管疾病风险的有效方法，最近世界卫生组织建议成年人每周至少进行150 min的有氧运动，以减少心血管疾病的风险[8]。有氧运动被证明可以减少炎症并改善CKD病人的血管内皮功能和动脉僵硬度/顺应性。先前的研究表明，有氧运动可以有效改善CKD病人的心肺功能和健康相关生活质量[9]。尽管运动训练可能是一个有前景的解决方案，但有氧运动训练对CKD病人的影响尚未完全阐明。因此，本研究探讨有氧运动通过TNFAIP3介导的NF-κB抑制磷酸诱导的血管钙化的实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠 选取50只12周龄C57Bl/6小鼠，体质量(18±4)g，购自南京博恩生物技术有限公司。将小鼠置于标准无特定病原体环境：室内恒温24 ℃，空气相对湿度60%，给予光照/黑暗循环(12 h光照、12 h黑暗交替)，饲养期间可随意获取食物和自来水。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院实验动物护理进行，并获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验分组 将小鼠分为对照组、模型组、有氧运动组，每组15只。对照组小鼠未进行肾切除术，接受标准啮齿动物饮食；模型组通过肾切除术和高磷酸盐饮食诱导小鼠CKD和血管钙化；有氧运动组小鼠在成功诱导CKD和血管钙化后，在跑步机上进行有氧运动，持续8周。

1.3 CKD模型建立 实验小鼠进行右肾次全肾切除术，进行左肾切除术。从外科手术中恢复后，饮食改为富含磷酸盐的饮食(0.6%钙、0.9%磷)，持续6周。通过光度法(FUJI FDC 3500i/4000i，Sysmex)测量模型小鼠血浆尿素氮(BUN)、磷酸盐和钙浓度，未进行肾切除术的对照小鼠接受标准啮齿动物饮食。实验结束后，通过眶后穿刺收集血液。在吸入异氟醚麻醉下通过颈椎脱臼处死小鼠，快速收集主动脉组织并速冻。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠有氧运动 对于有氧运动，小鼠从外科手术中恢复后在跑步机(哥伦布仪器exer-3/6/小鼠平板跑步机)上适应1周，并进行为期8 周的锻炼方案，期间没有倾斜或电击刺激。运动速度从每周 12.5 m/min增加到 18.5 m/min，每天运动时间从 30 min增加到50 min。由于小鼠之间的运动能力略有不同，因此，记录每只小鼠的每日跑步距离，并将总跑步距离用作运动能力的衡量标准。

1.4.2 实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR) 根据制造商的说明，使用 Trifast 试剂(Peqlab)从小鼠主动脉组织中分离总 RNA。使用 oligo(dT)12-18 引物(赛默飞世尔科技) 和SuperScriptⅢ逆转录酶(赛默飞世尔科技) 对 2 μg RNA 进行逆转录。根据制造商的说明，使用 iCycler iQTM 实时聚合酶链式反应(PCR)检测系统(生物放射实验室)和 iQTM Sybr Green Supermix(生物放射实验室)进行RT-PCR。PCR 产物的特异性通过熔解曲线分析得到证实。所有 PCR 均一式两份进行，相对 mRNA 倍数变化通过 2-ΔΔCt方法使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。通过RT-PCR检测小鼠主动脉成骨标志物、炎性因子mRNA表达，主动脉成骨标志物包括msh同源框2(MSX2)、核心结合因子α-1(CBFA1)和组织非特异性碱性磷酸酶(ALPL)；炎性因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-18(IL-18)。

1.4.3 蛋白质印迹分析 将小鼠主动脉组织用冰冷的免疫沉淀(IP)裂解缓冲液(赛默飞世尔科技)裂解，并辅以完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技)。在 10 000 r/min 离心 5 min后，将蛋白质在 Roti-Load1 缓冲液中于10 ℃下煮沸 10 min。在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与一抗在 4 ℃下孵育过夜：小鼠抗 A20辣根过氧化物酶(HRP)偶联(稀释1∶1 000，sc-166692，圣克鲁斯生物技术公司)，山羊抗NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)(1∶1 000，Abcam，USA)，兔抗磷酸化核因子κB抑制蛋白α(IκBα)(Ser32，稀释 1∶1 000，#2859，Cell Signaling)，兔抗核因子κB抑制蛋白α(IκBα，稀释 1∶1 000，#4814，Cell Signaling)，兔抗NF-κB p65(稀释 1∶1 000，#8242，Cell Signaling)，人骨形态发生蛋白-2(BMP2，1∶1 000，Abcam，USA)，Caspase-1(1∶1 000，Abcam)，或兔抗GAPDH 抗体(1∶5 000 稀释，#2118，Cell Signaling)，使用二级抗山羊HRP偶联抗体(1∶5 000 稀释，圣克鲁斯生物技术公司)或抗兔 HRP 偶联抗体(1∶1 000 稀释)，Cell Signaling) 在室温下保持 1 h。对于上样对照，将膜在室温下在剥离缓冲液(赛默飞世尔科技)中剥离10 min。用增强化学发光法(ECL)用试剂(赛默飞世尔科技)检测抗体。通过使用 Image J软件对条带进行量化。通过蛋白印迹和RT-PCR检测小鼠动脉组织中TNFAIP3的mRNA和蛋白表达；通过蛋白印迹检测小鼠主动脉中磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65蛋白表达以及主动脉中血管钙化、炎症小体相关蛋白BMP2、NLRP3和Caspase-1表达。

1.4.4 血管钙化的定量 细胞和主动脉的钙沉积通过钙含量检测试剂盒(Leagene，北京，中国)进行定量。对于细胞培养，去除培养基并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后收集血管平滑肌细胞(VSMC)。对于主动脉，将主动脉切成约 1mm3的碎片。主动脉以3 000×g离心 3 min。上清液用于检测钙含量。在酶标仪(VARIOSKAN LUX，美国热科学公司)上在 610 nm 处测定吸光度。蛋白质浓度通过 BCATM蛋白质测定法(Pierce，美国)定量。钙含量通过蛋白质浓度标准化。

1.4.5 茜素红染色 茜素红染色用于动脉钙化，用PBS洗涤主动脉以去除血液并在95%乙醇溶液中浸泡过夜。将主动脉与溶解在 1% KOH 中的 0.004% 茜素红孵育过夜，用 2% KOH 洗涤2次。对于主动脉的paraffin部分，主动脉段固定在4%多聚甲醛中并嵌入paraffin中。主动脉样本被切成 6 μm 厚。切片脱蜡，0.2%茜素红染色5 min，去离子水洗涤。将切片依次在无水丙酮溶液中浸泡30 s，无水二甲苯浸泡1 min。

2 结 果

2.1 3组TNFAIP3表达比较 模型组TNFAIP3的mRNA和蛋白表达较对照组降低(P<0.05)，有氧运动组TNFAIP3的mRNA和蛋白表达较模型组升高(P<0.05)。详见表1。

表1 3组TNFAIP3表达比较(±s)

2.2 3组小鼠主动脉中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达比较 模型组p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达较对照组升高(P<0.05)，有氧运动组p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达较模型组降低(P<0.05)，提示有氧运动降低小鼠NF-κB磷酸化和蛋白的表达。详见图1及表2。

图1 蛋白印迹法检测p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达

表2 3组小鼠主动脉中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达比较(±s)

2.3 3组主动脉成骨标志物mRNA表达比较 模型组MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表达较对照组升高(P<0.05)，有氧运动组MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表达较模型组降低(P<0.05)，提示有氧运动可降低主动脉成骨标志物mRNA表达。详见表3。

表3 3组主动脉成骨标志物mRNA表达比较(±s)

2.4 3组BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表达比较 模型组BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表达较对照组升高(P<0.05)，有氧运动组BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表达较模型组降低(P<0.05)，提示有氧运动可抑制血管钙化和炎症小体相关蛋白的表达。详见表4。

表4 3组BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表达比较(±s)

2.5 3组主动脉钙含量比较 通过钙含量检测试剂盒检测小鼠主动脉中的钙含量，模型组钙含量较对照组升高(P<0.05)，有氧运动组钙含量较模型组降低(P<0.05)。主动脉切片茜素红染色显示，与对照组相比，模型组出现严重的血管钙化，而有氧运动组抑制矿物质沉积，血管钙化较模型组减轻(P<0.05)。详见图2、表5。

图23 组小鼠主动脉茜素红染色结果

表5 3组主动脉钙含量比较(±s) 单位：μg/mg

2.6 有氧运动抑制血管钙化 模型组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表达较对照组升高(P<0.05)，有氧运动组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表达较模型组降低(P<0.05)，提示有氧运动可降低小鼠体内炎性因子表达。详见表6。

表6 3组炎性因子的mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

CKD是一个全球性的公共卫生问题。成人CKD的身体素质逐渐降低，主要原因是肾性贫血和骨骼肌疾病[10]。有氧运动训练是应用最广泛的项目，定期锻炼可改善CKD病人的心肺功能、力量和身体功能。据报道，在血压正常和高血压受试者中，有氧训练可以降低静息血压，尤其是在高血压受试者中[11]。透析的CKD病人的发病率和死亡率风险增加，部分原因是与身体机能下降有关。几项针对CKD的研究表明，有氧运动对身体机能和健康有益。炎症是血管钙化的促进剂，不仅会引起血管平滑肌细胞损伤，还会导致肝脏分泌胎球蛋白A减少[12]。其他研究表明，有氧运动训练可以降低非透析依赖性CKD病人的血浆C反应蛋白(CRP)和IL-6水平。

本研究结果表明，主动脉血管钙化的小鼠在进行渐进式有氧运动后，其血管钙化程度显著降低。平滑肌细胞能够在病理条件下改变其表型并释放基质囊泡并启动动脉矿化，其过程类似于生理性骨矿化。在高磷酸盐刺激期间，平滑肌细胞分化为具有成骨/成软骨细胞表型的细胞。表型转分化的特征在于成骨转录因子的表达，如MSX2和CBFA1。成骨/成软骨细胞表达ALPL，它水解内源性钙化抑制剂焦磷酸盐，从而促进磷酸钙晶体不受控制的形成[13]。平滑肌细胞的表型转分化受复杂的信号通路调节，与全身炎症有关，并且至少部分依赖于转录因子NF-κB，已成为血管钙化的关键调节因子[14]。这项研究表明，在动物模型中，有氧运动在血管钙化期间提供了强大的保护作用，改善小鼠血管平滑肌细胞的骨/软骨形成作用。有氧运动增加TNFAIP3表达，抑制高磷血症期间NF-κB的活化。转录因子NF-κB已成为血管平滑肌细胞软骨形成分化的关键调节因子。NF-κB激活导致MSX2依赖性ALPL表达，CBFA1上调并干扰平滑肌细胞中的抗钙化途径。有氧运动能够改变NF-κB活性。TNFAIP3表达上调对介导有氧运动的抗钙化作用至关重要[15]。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反过来通过负反馈机制抑制NF-κB活性。研究中发现，小鼠高磷酸盐饮食增加的IκBα磷酸化，而这些通过后期有氧运动逆转。因此，通过上调TNFAIP3抑制NF-κB可能是有氧运动在钙化中的保护作用的基础。

本研究表明，有氧运动可能通过影响NLRP3/Caspase-1和NF-κB通路来抑制体内炎症，从而减轻血管钙化，有氧运动抑制血管平滑肌细胞中钙沉积BMP2的表达。BMP2是平滑肌细胞成骨分化的关键标志物。血管钙化与肝脏和肾脏等多个器官有关，现在被认为是一种类似于成骨的活跃基因调节过程[16]。血管钙化最明显的病理特征是主动脉中的矿物质沉积。其他病理特征包括主动脉弹性蛋白损伤和断裂引起的管腔面积扩大和主动脉周长延长[17]。使用茜素红染色的主动脉旁切面进一步证实了这一结果。钙含量的定量分析也显示有氧运动对血管钙化的抑制作用。结果显示，有氧运动可能通过调节NLRP3/Caspase-1/IL-1β和NF-κB通路抑制炎症。据报道，在CKD病人中发现了严重的局部血管炎症和全身炎症[18]。在没有可见矿物质沉积的情况下甚至可以看到局部血管炎症并且血管钙化开始于局部血管炎症区域，这表明局部血管炎症的发生早于血管钙化[19]。血管炎症会诱导主动脉中的钙沉积，而钙沉积又通过诱导促炎细胞因子(如IL-1β和TNF-α)的表达来促进炎症反应，导致恶性循环，加重血管钙化[20]。本研究结果显示，接受肾次全切除术的小鼠在高磷酸饮食后诱导了IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表达，其中IL-1β表达最为明显，有氧运动显著下调上述促炎细胞因子的表达。本研究结果还显示，有氧运动对血管钙化具有强大的抗炎作用。由于NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路介导炎症，本研究探讨了有氧运动在血管炎症期间对该通路的影响。在血管炎症过程中，NLRP3炎症小体被激活，激活Caspase-1，随后诱导IL-1β的产生，最终诱导血管炎症的发生。

综上所述，有氧运动通过上调TNFAIP的表达介导NF-κB磷酸化抑制，并阻碍NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的激活来抑制血管炎症，从而防止血管钙化。有氧运动在临床上治疗血管钙化具有很大潜力，可以减少CKD病人血管钙化和心血管疾病的进展。