基于不同皮肤模型的复方南星止痛膏透皮吸收行为研究

乔鹏丽,魏旭超,瞿叶清,董洁,殷书梅,郑仕中,陈军

(1.南京中医药大学江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;3.南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心,江苏 南京 210008;4.江苏康缘阳光药业有限公司,江苏 南京 210046)

中药成方制剂复方南星止痛膏(Compound nanxing zhitong plaster,CNZP)属于外用橡皮膏制剂,由肉桂、丁香、白芷、生天南星、徐长卿等12味中药组成,主要用于治疗寒湿瘀阻证的骨性关节炎[1-2]。CNZP通过经皮给药的方式,具有避免胃肠首过效应,减少给药次数等优点,其透皮吸收效果直接决定药效,目前主要通过体外透皮吸收实验表征CNZP中活性成分的吸收特性[3]。

经皮给药研究成功的关键因素之一在于选择与人体皮肤渗透性相似的皮肤模型,目前经皮渗透研究比较公认的最接近人体皮肤性质的是猪耳皮[4],但比较难获得,因此常用其他动物皮肤模型如大鼠皮替代。人工皮肤膜的出现,为替代动物皮肤模型提供了可能[5],课题组前期研制了“砖-砂浆”结构的复合磷脂脂质体人工皮肤膜(Composite phospholipid liposome-based artificial skin membrane,CPLASM)以模拟皮肤角质层的组成与结构,能有效表征中药溶液中活性成分的透皮吸收行为[6-7],但尚未有用于中药成方制剂的研究。

本文在建立同时测定CNZP中5种活性成分HPLC方法的基础上,以真实皮肤猪耳皮和大鼠皮为对照,制备CPLASM并考察了其与市售Strat-MTM人工皮肤膜用于评价CNZP体外透皮吸收行为的效果,以期为以CNZP为代表的中药贴膏剂提供能够替代动物皮肤的评价模型和表征方法,从而有效评价其透皮吸收性质以控制质量。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,购自浙江维通利华实验技术有限公司,生产许可证号:SCXK(浙)2019-0001。巴马小型猪,体质量(18±2)kg,江苏亚东动物研究院有限公司,生产许可证号:SCXK(苏)2021-0015。

1.2 实验试剂与仪器

标准品桂皮醛(批号：B50765)、丹皮酚(批号：B20266)、丁香酚(批号：B20301)、水杨酸甲酯(批号：B21198)、欧前胡素(批号：B20929)(纯度均高于95%,上海源叶生物科技有限公司),CNZP(江苏康缘阳光药业有限公司,批号：220202),氢化大豆磷脂(上海艾韦特医药科技有限公司),大豆磷脂(上海艾韦特医药科技有限公司),胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司),胆固醇硫酸酯钠(上海美仑试剂公司),聚乙二醇400(PEG400,国药集团化学试剂有限公司),甲醇(美国Tedia公司,色谱纯),乙腈(美国Anaqua公司,色谱纯),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

Strat-MTM(Merck millipore公司),24孔嵌套、24孔板(Corning公司,TranswellTM),高效液相色谱仪[沃特世科技(上海)有限公司,Waters2695型],紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司,UV2800AH型),涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂有限公司,XW80A型),超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司,KH5200E型),离心机(上海安亭科学仪器厂,TGL-16B型),分析天平(奥多利斯科学仪器北京有限公司,BT124S型),超纯水机(Merck Millipore,DIRECT-Q5型),透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司,TK-12D型)。

2 方法和结果

2.1 HPLC测定活性成分含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Ultimate XB-C18柱(250 mm×2.6 mm,5 μm),流动相乙腈-水,梯度洗脱条件见表1,柱温30 ℃,流速1 mL·min-1,检测波长276 nm,进样体积10 μL。

表1 梯度洗脱条件

2.1.2 样品溶液的制备

2.1.2.1 供试品溶液的制备 剪取CNZP膜片约0.22 g,精密称定,加入甲醇8 mL,冰浴超声提取60 min,超声提取后4 000 r·min-1冷冻离心10 min,上清液转移至25 mL容量瓶中,重复3次,最后加甲醇定容至刻度,摇匀,即得。

2.1.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素对照品适量于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容得到混合对照品溶液,桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素质量浓度分别为10.14 μg·mL-1、9.42 μg·mL-1、144.44 μg·mL-1、96.96 μg·mL-1、7.36 μg·mL-1。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 专属性考察 取CNZP供试品溶液、已知浓度混标工作液和透皮接收液溶液,按“2.1.1”项下色谱条件检测。见图1。

注：A.混合对照品溶液;B.CNZP供试品溶液;C.透皮接收液

2.1.3.2 线性关系考察 取“2.1.2.2”混合对照品溶液用甲醇逐级稀释成5份不同浓度的混标工作液,按“2.1.1”项下色谱条件进行分析。以被测化合物的峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归。结果分别为:桂皮醛(Y=80 787X+13 108,R2=0.999 4)、丹皮酚(Y=49 616X+4 219.3,R2=0.999 8)、丁香酚(Y=3 017.4X+9 722.6,R2=0.999 8)、水杨酸甲酯(Y=8 590.4X+10 500,R2=0.999 9)、欧前胡素(Y=15 076X+1 093.7,R2=0.999 2),线性范围分别为:桂皮醛0.32～10.14 μg·mL-1,丹皮酚0.29～9.42 μg·mL-1,丁香酚4.51～144.44 μg·mL-1,水杨酸甲酯3.03～96.96 μg·mL-1,欧前胡素0.23～7.36 μg·mL-1。

2.1.3.3 精密度试验 取“2.1.2.2”项下混合对照品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,以被测化合物的峰面积(Y)为指标,计算相对标准偏差(RSD)为精密度。桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素的RSD分别为0.72%、0.98%、0.79%、0.60%、0.71%,表明仪器精密度良好。

2.1.3.4 重复性试验 取“2.1.2.1”项下供试品溶液,平行制备6份,按“2.1.1”项下色谱条件进样,测定并计算各成分的RSD,桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素的RSD分别为1.09%、1.23%、0.88%、0.88%、1.09%,表明该方法重复性良好。

2.1.3.5 稳定性试验 取“2.1.3.4”项下同一份供试品溶液,分别于0、4、8、12、24、48 h进样,按“2.1.1”项下色谱条件进样,测定并计算各成分峰面积的RSD。桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素的RSD分别为2.24%、2.18%、2.28%、2.51%、1.68%,表明各成分在48 h内稳定性良好。

2.1.3.6 加样回收率 称取0.11 g CNZP 6份,测定各成分的含量,分别加入等量混合对照品后按“2.1.2.1”项下制备供试品溶液并进样测定。取透皮接收液6份,分别接入等量混合对照品,进样测定。CNZP供试品溶液中桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素的加样回收率分别为(104.53±0.36)%、(101.95±0.34)%、(101.84±0.37)%、(99.63±0.25)%、(105.33±1.22)%;接收液中桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯、欧前胡素的加样回收率分别为(97.77±0.11)%、(107.91±1.78)%、(107.48±0.35)%、(95.46±0.85)%、(104.48±1.43)%,表明方法准确度良好。

2.1.3.7 CNZP成分含量测定 取“2.1.2.1”项下供试品溶液进样测定。CNZP中各成分含量分别为桂皮醛(0.34±0.03)mg·g-1,丹皮酚(0.78±0.13)mg·g-1,丁香酚(6.24±3.03)mg·g-1,水杨酸甲酯(16.19±0.96)mg·g-1,欧前胡素(0.22±0.04)mg·g-1(n=3)，，可见水杨酸甲酯和丁香酚的含量最高。

2.2 透皮吸收行为考察

2.2.1 猪耳皮制备 于-20 ℃冰箱中取出猪耳恢复至室温,用刀片将猪耳背部毛剔除干净,剥离猪耳背部皮肤,除去皮下血管及组织,于-20 ℃保存,实验使用前将皮肤自然解冻。

2.2.2 大鼠皮制备 取SD大鼠,麻醉后固定在大鼠板上。肥皂水湿润毛发,用刀片轻轻刮去腹部毛发,用纸巾吸干表面水分,饲养过夜。取脱毛后大鼠,颈椎脱臼处死,采用手术器械小心剥取腹部皮肤,去除皮下脂肪及黏液组织,置于滤纸夹层中,-20 ℃冰箱保存，2周内使用。实验前将皮肤解冻,检查皮肤的完整性。

2.2.3 CPLASM的制备 采用薄膜分散法制备复合磷脂脂质体[6-7],小粒径脂质体:大豆磷脂-胆固醇(77∶23,w/w);大粒径脂质体:大豆磷脂-氢化大豆磷脂-神经酰胺-胆固醇-胆固醇硫酸酯-棕榈酸(56.25∶18.75∶13.75∶6.25∶1.25∶3.75,w/w)。制备好的小粒径脂质体混悬液用高压均质机控制粒径在200～300 nm,大粒径脂质体混悬液用探头式超声仪控制粒径大于500 nm。

将粘有尼龙膜的嵌套放在24孔板中,加入小粒径脂质体100 μL,2 000 r·min-1离心10 min,更换24孔板方向重复上述步骤,去除多余混悬液,50 ℃加热干燥45 min。后加入大粒径脂质体100 μL,2 000 r·min-1离心10 min。55 ℃加热干燥2 h,放入-80 ℃冰箱冷冻1 h,然后真空干燥箱30 ℃加热2 h,冻融循环2次。制备好的CPLASM置于-20 ℃储存。

2.2.4 CNZP活性成分体外透皮(膜)吸收 取Strat-MTM、大鼠皮和猪耳皮于PBS(pH7.4)中水合1 h,角质层朝上安装在Franz扩散池上,取CNZP圆片称质量后置于皮肤表面,接收液采用超声脱气的30%PEG400生理盐水。透皮扩散仪保持恒温，循环水浴温度37 ℃,转速300 r·min-1。分别在不同时间点取接收液0.3 mL(及时补充等温空白接收液),14 000 r·min-1冷冻离心10 min,取上清液用HPLC法测定浓度并计算单位面积累计透过量。

取CPLASM,加入PBS(pH7.4)中水合1 h,下层加入600 μL超声脱气的30%PEG400生理盐水,上层加入CNZP圆片,分别在不同时间点取接收液0.3 mL(及时补充等温空白接收液),14 000 r·min-1冷冻离心10 min,取上清液用HPLC法测定浓度并计算单位面积累计透过量。

按公式Q=(V×Cn+∑VS×Cn-1)/A求算不同时间单位面积的药物累积透过量(Q);A为有效透皮吸收面积(3.14 cm2),V为接收室体积,Vs为取样体积,Cn为第n个取样点测得的接收液中药物质量浓度(μg·mL-1),Cn-1为第n-1个取样点测得的接收液中药物质量浓度(μg·mL-1)。以各时间点Q为纵坐标,时间t为横坐标作图,将曲线尾部直线部分数据进行线性回归,得到Q-t方程,直线的斜率为稳态流量(Jss,μg·cm-2·h-1),表观渗透系数Papp=Jss/(3 600×C0),C0为加入供给室中各成分初始质量浓度。

结果如图2和表2所示,采用猪耳皮和大鼠皮评价CNZP中各活性成分的透过能力排序依次是:桂皮醛>丁香酚>丹皮酚>欧前胡素>水杨酸甲酯,采用Strat-MTM和CPLASM评价得到的渗透量排序依次是:桂皮醛>丁香酚>水杨酸甲酯>丹皮酚>欧前胡素。在5种活性成分中,桂皮醛和丁香酚是透过性能最好的2种成分。

图2 CNZP 5种活性成分体外透皮行为

以接近人皮的猪耳皮为对照,同时选取实验室常用的大鼠腹部皮肤做对照,对CNZP中5种活性成分在猪耳皮、大鼠皮、Strat-MTM和CPLASM的表观渗透系数(Apparent permeability coefficient,Papp)进行相关分析(表2,图3)。相关性比较结果显示,猪耳皮的Papp与CPLASM和Strat-MTM的Papp相关性系数(R)分别是0.965 8和0.943 3。大鼠皮的Papp与CPLASM和Strat-MTM的Papp相关性系数(R)分别是0.949 3和0.946 0。与市售Strat-MTM的体外透皮结果相比,CPLASM对CNZP中5种活性成分的透皮吸收行为的表征效果与猪耳皮和大鼠皮的基本一致,Papp相关性优于采用Strat-MTM的评价结果。

表2 CNZP中5种活性成分采用Strat-MTM、猪耳皮、CPLASM及大鼠皮评价得到的透皮参数

图3 CNZP 5种活性成分在不同皮肤模型中的透皮参数相关性

3 讨论

CNZP作为成方制剂上市20余年,因其疗效确切,深受广大患者好评,目前对于其透皮吸收研究主要有指标性成分丁香酚、欧前胡素的透皮行为,凝胶膏剂、压敏胶贴剂等剂型对丁香酚透皮吸收的影响,以及水杨酸甲酯在CNZP中对活性成分的促渗作用影响[8-11],为CNZP剂型优化和质量控制提供了依据。李璐等[3]对CNZP主要药物丁香、肉桂、徐长卿中发挥消炎抗菌镇痛作用的成分丁香酚、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和水杨酸甲酯在不同接收介质(生理盐水,pH7.4磷酸盐缓冲液和30%PEG400生理盐水)中的透皮扩散规律进行研究,发现5种成分均能够透过裸小鼠皮肤进而发挥药效,并且确定最佳的接收介质为含有30%PEG400的生理盐水,因此本实验采用该介质作为透皮接受液。

目前常用于透皮吸收研究的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、猪和兔等,其中裸小鼠毛囊[12]数目和直径与有毛小鼠相比更接近人类皮肤,但其角质层厚度减半,透皮吸收参数评价结果有时与人皮结果差异较大。大鼠皮肤[13]因获得容易而应用较多。小型猪是公认[14-15]的经皮渗透研究实验动物,透射电镜结果显示猪皮肤表皮-真皮连接结构与人皮肤相似[16],但价格昂贵。采用动物皮肤评价透皮吸收往往受动物的品系、年龄、性别、部位差异的影响而差异较大,皮肤制备过程也会影响皮肤的渗透性,因此采用人工皮肤膜[6]替代动物皮肤是大势所趋,不仅能够有效模拟人皮或猪耳皮,而且能够减少评价结果的差异。

本实验通过优化HPLC方法,实现了同时测定CNZP中5种活性成分的透皮吸收行为,同时首次采用CPLASM和Strat-MTM与大鼠皮、猪耳皮对成方制剂CNZP中5种活性成分的透皮吸收行为进行比较研究,结果表明CNZP中5种活性成分在CPLASM的透皮行为与真实皮肤的相关度高于市售Strat-MTM人工皮肤膜,因此有望能够替代动物皮肤应用于中药贴膏剂的体外透皮吸收评价,为中药经皮给药制剂的质量控制提供有效手段。

采用人工皮肤膜评价水杨酸甲酯的结果偏高,其原因可能是水杨酸甲酯的脂溶性较高,因而对于脂质结构的人工皮肤膜透过性更好,而对于含有水性通道的真实皮肤透过性相对较低。因此未来的人工皮肤膜可能也要在成分上考虑采用角蛋白以构建水性通道,以便进一步提升模拟真实皮肤的效果。