克班宁贴剂在大鼠体内的药动学与药效学评价

崔利利,李婧瑜,徐鹤,杨子贤,马云淑,4,5

(1.云南中医药大学中药学院,云南 昆明 650500;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;3.云南省疾病预防控制中心,云南 昆明 650000;4.云南省傣彝学重点实验室,云南 昆明 650500;5.云南省南药可持续利用重点实验室,云南 昆明 650500)

克班宁(Crebanine,Cre)提取自防己科千金藤属植物云南地不容StephaniayunnanensisLo块根中[1],属于异喹啉类阿朴菲型生物碱。阿朴菲型生物碱对离子通道、神经系统、肾上腺受体等有一定的生物活性[2],其中离子通道作用主要表现为对Na2+通道、K+通道、Ca2+通道的阻滞。马云淑等[3-7]对克班宁的抗心律失常作用做过深入研究,结果表明克班宁具有显著的抗心律失常作用,具有较好的开发研究前景。目前研究表明，克班宁静注抗心律失常治疗指数小,安全范围窄,剂量不当易导致中毒或死亡,且经静注或灌胃给药的克班宁抗心律失常虽起效快,但持续时间短且作用不稳定。

因此本研究将克班宁制备成透皮贴剂,以延长作用时间,降低毒副作用。通过对比克班宁经透皮和灌胃2种不同给药方式的药动学参数,比较经皮和胃肠道吸收的差别。建立氯化钡(BaCl2)致大鼠心律失常模型,考察克班宁贴剂抗心律失常的作用,在分子水平上探究克班宁抗心律失常的机制,为满足临床多途径给药及药物增效减毒提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent，1260);生物机能实验系统(成都泰萌科技有限公司,BL-420E);氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司,HSC-12A);微量紫外分光光度计(Eppendorf，D30)；数模转换器(Axon，1550B)；信号放大器(Axon，200B)；电极抛光仪(Narishige，MF-830)；水平程控电极拉制仪(SUTTER Instrument，P97)；玻璃电极(World Precision Instrument，P97)。

1.2 试药

克班宁(实验室自制,含量96.17%);克班宁标准品[8]:实验室自制(纯度98%);丁香(Flos Caryophyllii)购于昆明市螺蛳湾中药材专业市场,经鉴定为桃金娘科番樱桃属植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾,按照2020版《中国药典》挥发油测定法提取丁香挥发油,收率为9.63%,经GC-MS检测,主要含丁香酚(66.10%)、β-石竹烯(25.02%)、乙酰基丁香酚(4.17%);盐酸维拉帕米(中国食品药品检定研究院,批号：100223-200102)；甲醇(色谱纯,MERCK);乙酸乙酯(分析纯,天津市大茂化学试剂厂,批号：20150513)。

1.3 实验动物

SD大鼠,SPF级,体质量250～300 g,雌雄各半,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2013-0004,伦理号:No.R-062016002。

2 方法

2.1 克班宁贴剂的制备[9]

精密称取处方量Eudragit EPO(0.625 g)、邻苯二甲酸二乙酯(0.187 5 g)、丁二酸(0.031 25 g)、甘油(0.125 g)于烧杯中,加入克班宁(0.125 g),加入适量70%乙醇搅拌使完全溶解,而后分别加入基质比1%的氮酮、基质比3%的丁香挥发油制备含不同促渗剂的贴剂。将上述溶液均匀涂布于30 cm2的模具,45 ℃烘箱干燥1 h,取出,冷却至室温,覆合保护膜,即得克班宁贴剂。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取15 mg克班宁对照品于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度线,得到1.5 mg·mL-1的克班宁对照品溶液,进一步稀释为0.033、0.833、1.667、3.333、6.667、16.667 μg·mL-1系列的克班宁对照品溶液,-20 ℃密封保存备用。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取维拉帕米10 mg至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,进一步稀释得到100 μg·mL-1维拉帕米内标液,-20 ℃密封保存备用。

2.2.3 克班宁溶液配制 称取克班宁对照品100 mg于10 mL容量瓶中,加入1%柠檬酸水溶液适量超声溶解,用饱和NaOH水溶液调节pH至6～7,再用生理盐水定容至刻度,即得10 mg·mL-1的克班宁溶液。

2.3 血浆样品的处理方法

精密吸取大鼠血浆样品200 μL,加入100 μg·mg-1维拉帕米甲醇溶液20 μL,加入1 200 μL乙酸乙酯,涡旋振荡3 min,4 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液于50 ℃水浴上氮气流吹干,加入150 μL甲醇涡旋3 min复溶,经0.22 μm微孔过滤器过滤,HPLC进样分析。记录色谱图与峰面积。

2.4 方法学考察

2.4.1 色谱条件 Agilent 1260高效液相色谱系统。色谱柱:Agilent ZORBAX Extend-C18(5 μm,4.6 nm×250 nm);流动相:甲醇-0.01%三乙胺(75∶25);流速:1 mL·min-1;检测波长:280 nm;柱温:30 ℃;进样量:25 μL。

2.4.2 专属性考察 空白血浆，空白血浆中加入内标和克班宁溶液(由180 μL空白血浆、20 μL内标、20 μL克班宁甲醇溶液组成)以及克班宁贴剂给药2 h后的血浆样品分别按照“2.3”项处理方法(空白血浆内标溶液以同体积甲醇替代)处理进样,记录色谱图。分离度大于1.5,拖尾因子皆在0.95～1.05,理论塔板数大于4 000,克班宁与内标分离度好,均大于1.5,且内源性物质无干扰。结果见图1。

注：A.空白血浆；B.空白血浆+内标+克班宁溶液;C.克班宁贴剂给药；1.维拉帕米;2.克班宁

2.4.3 标准曲线 精密吸取200 μL大鼠空白血浆,分别加入25 μL克班宁对照品溶液和20 μL内标溶液,按照“2.3”项处理方法处理进样。以克班宁和维拉帕米峰面积比值作为纵坐标(Y),克班宁浓度(X)作为横坐标进行线性回归。得标准曲线为:Y=0.543 5X-0.102 1(R2=0.999 3)。结果表明:克班宁血浆溶液在0.033～16.667 μg·mL-1之间线性关系较好。

2.4.4 精密度 于1 d内3个不同时间精密吸取空白血浆200 μL,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)剂量克班宁甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”项处理方法处理进样,计算日内精密度RSD分别为6.54%、7.53%、12.93%。连续3 d内测定并处理进样,计算日间精密度RSD分别为5.57%、8.96%、10.44%。

2.4.5 回收率 精密量取空白血浆200 μL,分别加入配制的高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)剂量克班宁甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”项处理方法处理进样,计算平均方法回收率,分别为(91.85±0.027)%、(96.90±0.016)%、(99.99±0.097)%,RSD分别为3.20%、2.34%、10.64%。计算平均回收率,分别为(105.75±0.038)%、(96.19±0.046)%、(98.50±0.160)%,RSD分别为3.39%、4.04%、11.11%。

2.4.6 稳定性 精密量取空白血浆200 μL,室温放置12 h,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)剂量克班宁甲醇溶液25 μL各3份,按照“2.3”项处理方法处理进样,计算室温放置12 h稳定性RSD分别为5.13%、4.89%、3.56%。另取上述高、中、低剂量克班宁甲醇溶液的血浆样品各3份,于-20 ℃保存72 h后取出,按照“2.3”方法处理进样,计算-20 ℃冻融稳定性RSD分别为4.94%、4.22%、2.42%。

2.5 克班宁贴剂给药

取大鼠18只,体质量250～300 g,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。分别在给药前一天脱去大鼠腹部毛,脱毛面积30 cm2,洗净、饲养、待用。给药剂量400 mg·kg-1。随机分成克班宁贴剂阴性组(不含促渗剂的克班宁贴剂)、阳性组(含1%氮酮的克班宁贴剂)、实验组(含3%丁香挥发油的克班宁贴剂)。给药时贴剂黏贴于大鼠脱毛皮肤上,并用医用胶带固定。各组在给药后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h眼后丛静脉采血于肝素钠抗凝管中,离心后取上层血浆。

2.6 克班宁灌胃给药

取大鼠6只,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。给药剂量为40 mg·kg-1。克班宁灌胃给药后分别在0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h眼后丛静脉采血于肝素钠抗凝管中,离心后取上层血浆。

2.7 克班宁贴剂对BaCl2诱发大鼠心律失常模型的药效学研究

SD大鼠60只,雌雄各半，于实验前一天将大鼠腹部毛去除干净(30 cm2),禁食不禁水待用，分别为空白对照组(给予不含克班宁的空白基质贴剂)、阳性组(30 mg·kg-1维拉帕米灌胃)、阴性组(腹部脱毛后医用胶带给予束缚处理)、克班宁低剂量组(79 mg·kg-1)、克班宁中剂量组(158 mg·kg-1)、克班宁高剂量组(316 mg·kg-1)。阳性对照组给药30 min后、其他各组给药10 h后,麻醉并仰卧固定于鼠板上,连接BL-420E生物机能实验系统,稳定5 min后记录正常Ⅱ导联心电图,2 min后舌下静脉注射0.4%BaCl24 mg·kg-1,观察记录心律失常心电图和恢复的心电图。

2.8 膜片钳Whole Cell记录方法

选择T-type和L-type两种钙通道,利用Patch Clamp技术,Whole Cell记录检测克班宁对这些通道电流的影响。选取边缘清晰、形态饱满、细胞膜平滑的细胞,控制微电极操作仪使玻璃电极轻触到所选细胞的细胞膜,给予负压抽吸,当封接电阻Rt值达到GΩ封接时,补偿快慢电容。破膜成功后将加药管中空气排出,使加药管滴速保持在1～2滴·s-1,在显微镜下动作轻且慢地将加药管尖端放入胞外液中并悬至待测细胞上方。打开刺激程序,开始记录。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 克班宁贴剂及灌胃给药的药动学结果

克班宁贴剂给药在大鼠体内消除慢,具有缓释作用。在克班宁贴剂阴性组(克班宁贴剂)、阳性组(含1%氮酮的克班宁贴剂)、实验组(含3%丁香挥发油的克班宁贴剂)中，克班宁贴剂实验组的克班宁吸收程度最大,在大鼠体内的停留时间最长，给药后迅速进入大鼠体内,消除慢,且血药浓度较高。与经皮给药比较,克班宁灌胃给药在大鼠体内血药浓度变化符合一室模型,达峰时间显著缩短,达峰浓度显著提高,但血药浓度下降快,维持时间短,结果见图2～3、表1。

图2 克班宁贴剂给药血药浓度-时间曲线

图3 克班宁灌胃给药血药浓度-时间曲线

表1 克班宁经皮、灌胃给药在大鼠体内的房室模型参数

3.2 克班宁透皮给药与灌胃给药对BaCl2致大鼠心律失常的影响

与阴性组比较,克班宁低、中、高剂量组恢复窦性心律所需的时间缩短(P<0.01)，给药后10 min内恢复窦性心律的鼠数增多(P<0.01，P<0.001),给药后20 min内恢复窦性心律的鼠数明显增多(P<0.001)，恢复窦性心律后维持时间大于20 min的鼠数也显著增多P<0.01)。结果见表2。

表2 克班宁贴剂经皮与灌胃给药对BaCl2致大鼠心律失常的影响

3.3 克班宁对心肌钙通道的作用

结果显示,30 μmol·L-1克班宁对T型钙通道和L型钙通道均有抑制作用,且这种抑制作用有剂量依赖性。对L-type钙通道：3 μmol·L-1克班宁的抑制率为26%，10 μmol·L-1的抑制率为31%，30 μmol·L-1的抑制率为46%，100 μmol·L-1的抑制率为96%，300 μmol·L-1的抑制率为100%,通过Hill方程拟合出其IC50为46.62 μmol·L-1。对T-type钙通道：3 μmol·L-1克班宁的抑制率为11%，10 μmol·L-1的抑制率为16%，30 μmol·L-1的抑制率为31%，50 μmol·L-1的抑制率为39%，100 μmol·L-1的抑制率为69%，300 μmol·L-1的抑制率为89%,通过Hill方程拟合出其IC50为72.70 μmol·L-1,结果见图4～5。

图4 30 μmol·L-1克班宁对L-type、T-type Ca2+通道的抑制作用

图5 克班宁对L-type、T-type Ca2+通道的剂量效应关系

4 讨论

克班宁灌胃给药在大鼠体内血药浓度变化符合一室模型,在胃肠道中吸收快,可以迅速进入体内,但药效结果表明灌胃给药作用时间不够持久,易反复。汪红梅等[7]提出克班宁灌胃可对抗BaCl2致大鼠实验性心律失常。从本研究药动学结果可知,克班宁贴剂可长时间持续缓慢释放药物,相对灌胃组可减少给药次数,延长给药时间。克班宁灌胃给药的Cmax=(8.991±2.343)mg·L-1,克班宁贴剂实验组Cmax=(1.968±0.147)mg·L-1；且药效学实验结果提示，克班宁贴剂虽起效时间有延迟,但恢复窦性心律后大部分大鼠均不再出现心律失常反复。克班宁贴剂实验组AUC0-∞、Cmax明显高于克班宁贴剂阴性组和阳性组,提示含有3%丁香挥发油的克班宁贴剂实验组有较好的促渗作用,在体内的吸收程度大,生物利用度高。综上所述可知,与灌胃给药相比,克班宁贴剂给药在较低血药浓度下就可发挥抗心律失常作用,且能长时间保持一定血药浓度水平,延长作用时间,达到了减毒增效预期目标。

在本实验中,贴剂药动学与药效学给予的剂量不一致,是由于贴剂经皮给药剂量低,进入血液含量较低,采用HPLC检测不到药物,故采用400 mg·kg-1给药进行药动学研究;而在药效学实验过程中,通过预实验发现给予较低剂量即可发挥抗心律失常作用。克班宁来源于实验室自提,提取过程中需要大量的试剂及原药材,出于节约资源等方面考虑,在药效研究中选取低(79 mg·kg-1)、中(158 mg·kg-1)、高(316 mg·kg-1)三个给药剂量。

据前期实验研究结果,克班宁的静脉注射半数致死量(LD50)是9.382 mg·kg-1,盐酸克班宁氰基丙烯酸正丁酯微粒LD50是9.984 mg·kg-1,盐酸克班宁PLGA纳米粒LD50是13.619 mg·kg-1，盐酸克班宁PELGE纳米粒LD50是14.839 mg·kg-1,克班宁脂质体LD50是16.085 mg·kg-1。而本研究中克班宁经皮贴剂吸收稳定且血药浓度峰谷波动小,经预实验发现在较大载药量与给药面积(400 mg·kg-1)下也未观察到大鼠中毒迹象,其呼吸、饮食、二便、日常活动、精神状态均表现正常,无一例死亡,故未能求出经皮给药LD50。显示了克班宁贴剂经皮给药安全高,毒性不明显。

心律失常是一种常见病、多发病,分为快速性心律失常和缓慢性心律失常。临床上治疗快速性心律失常最有效的方法是导管消融。安装起搏器仍是治疗缓慢性心律失常唯一有效的治疗措施,但这种治疗措施会对身体造成创伤且费用昂贵,不能广泛使用。药物治疗还是患者首选的治疗方案[10]。然而当前临床上用于治疗心律失常的药物仍是旧品种,常具有不良反应[11-12]。刘景文等[13]提出胺碘酮和异丙肾上腺素联用抗心律失常疗效确切,有效率可达81.25%,但对缓慢性心律失常的治疗效果不好。因此,开发治疗效果好、副作用少的抗心律失常药物是非常必要的。结合课题组前期研究可知,克班宁对KCNQ1/KCNE1、Kv1.5、T-type、L-type、Nav1.5这5个通道都有比较明显的抑制作用,属于多靶点抑制剂,对N型钙离子通道和P/Q型离子通道没有作用,这2种通道主要分布于神经而不存在于心脏中。同样值得关注的是克班宁对TRP通道的作用,克班宁能够激活TRPA1通道而抑制TRPM8通道。初步探究的结果证实克班宁符合新Ⅲ类抗心律失常药物的特点,且制备为经皮给药后,对大鼠心律失常有明显抑制作用,毒副作用显著降低、安全性高,具有较好的开发研究前景。