革兰氏阳性菌VicRK双组份信号转导系统调控功能的研究进展

龙莉，王一然，陈文川，王诗达

(四川大学华西口腔医学院·口腔疾病研究国家重点实验室·国家口腔疾病临床医学研究中心，四川 成都 610041)

VicRK(也称WalRK或YycFG)是革兰氏阳性菌中高度保守的双组份信号转导系统(two component system，TCS)之一。VicRK TCS最初在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)中因具有调控细胞分裂的功能得到关注，而后陆续在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)及变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)等致病菌中被发现[1-2]。与其他双组份系统一样，VicRK主要由两个部分组成，位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶VicK和胞内应答因子VicR。蛋白激酶VicK可感受细胞内外刺激发生自磷酸化，此后将磷酸基团传递给VicR蛋白。磷酸化的VicR(VicR-P)蛋白发生构象变化后可调控下游靶基因的表达，从而达到调控细胞功能的目的[2]。VicK的磷酸酶活性还可将VicR-P去磷酸化，在细胞功能调控中发挥重要作用[3-4]。作为一个与细胞壁代谢相关的信号调控系统，VicRK TCS在细胞分裂、细胞自溶、环境应激、生物膜形成及毒力因子表达、免疫调控等过程中都发挥着关键作用，影响细菌的生存力和致病性。

1 VicRK TCS调控细胞分裂的作用机制

在枯草芽孢杆菌中，vicR和vicK均为细菌生存的必需基因。利用底物启动诱导型启动子表达vicRK基因的条件下可成功构建vicRK基因敲除株，使得细胞分裂发生明显障碍、细胞壁结构产生缺陷，形成空泡结构(可能是细胞自溶的结果)。另一方面，vicR过表达导致枯草芽孢杆菌小细胞形成[5]，与其在金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌中类似[6-7]。ftsAZ是第一个被证实的受VicRK系统直接调控基因，与细胞分裂紧密相关。FtsZ可在细胞分裂时形成Z环，分隔姊妹细胞，形成细胞隔膜。VicK与FtsZ的相互作用可将VicK定位于细胞隔膜上，同时将VicR定位于拟核，这对于VicK磷酸化VicR、调控细胞分裂至关重要[8]。

肽聚糖骨架构成革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分，因此，肽聚糖的合成与水解是细胞分裂的一个重要环节。在肺炎链球菌中，VicRK主要通过PcsB半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(cysteine，histidine-dependent amidohydrolases/peptidases，CHAP)结构域蛋白调控肽聚糖的水解。且CHAP结构域蛋白在金黄色葡萄球菌及变异链球菌中也发挥着水解肽聚糖酶、调控细胞分裂的作用[9]。纯化的肺炎链球菌PcsB蛋白自身不具备水解酶活性，但当FtsXE蛋白与PcsB的相互作用使PcsB蛋白特异性定位于细胞隔膜后获得水解酶活性。FtsX缺失或PcsB缺失会造成类似细胞壁缺损的细胞表型[9-10]。此外，VicRK的另一个靶基因dacB也参与细胞分裂过程，dacB编码的L,D-羧肽酶主要参与肽聚糖的成熟，dacB缺失诱导细胞链延长和细胞不对称分裂[11]。

与枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌形相似，在变异链球菌中，VicK的缺失也使细胞分裂受阻、形成细胞长链[12]。此外，当VicK的磷酸酶受阻时，VicR-P的累积同样会影响细胞分裂。VicK磷酸酶受阻的变异链球菌表现出异常的细胞形态，且发生不对称分裂现象[4]。

2 VicRK TCS调控细胞自溶的作用机制

细胞自溶是由肽聚糖水解酶对细胞壁进行的自我消化，在细胞壁生物合成途径(包括细胞分离、肽聚糖重塑及eDNA释放)中发挥重要作用。自溶素(autolysin，Alt)负责肽聚糖的水解，其主要由氨基葡萄糖苷酶(glucosaminase，GL)和酰胺酶(amidase，AM)结构域组成，并通过两种细胞外裂解酶参与水解过程[13]。在枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、变异链球菌及格氏链球菌等革兰氏阳性菌中，VicRK TCS都参与了细胞壁水解过程[14]。枯草芽孢杆菌中，LytE、CwlO内肽酶(水解酶的一种)受VicRK直接调控[15]。金黄色葡萄球菌中，CidAB，Gcp对细胞自溶具有正向调节作用。VicRK系统除了通过调控自溶素AltA和AltM来控制细胞壁的代谢过程，还可以调控cidA的表达。下调VicR的表达水平会降低cidA基因的表达，抑制细胞自溶[13，16]。AltS是格氏链球菌中主要的自溶素，受到VicRK及LytST的调控。Liu等[17]研究表明，vicR或vicRK的缺失会使细菌对自溶的抵抗增强，而vicK缺失株在自溶方面表现出与野生株相似的生长曲线。此外，在变异链球菌及肺炎链球菌中，敲除vicK基因可抑制altA的表达，使细胞对自溶具有超抗性[18]。因此，VicRK TCS对革兰氏阳性菌的正常自溶过程极其重要。

3 VicRK TCS调控细胞环境应激的作用机制

细菌能精确的检测环境参数(pH、温度、氧分压、渗透压等)并做出适应性改变，这也是其能够在复杂环境中生存的基础。VicRK TCS在革兰氏阳性菌应对环境应激的过程中有着重要的调控作用。在枯草芽孢杆菌中，热刺激(42 ℃)可提高VicRK的表达水平[19]。Takada等[20]也表明当温度升高至60 ℃时，VicK的自动磷酸化水平升高[20]。因此，枯草芽孢杆菌的VicRK对温度变化也会产生一定的适应性改变。变异链球菌的耐酸性是其致病性的重要因素之一。将变异链球菌置于pH=5.5的酸性环境中，atpE/A、ffh、radA、gcrR等经典的耐酸反应基因的表达水平是在pH=7.5中的两倍及以上。而VicK缺失的变异链球菌无法抵抗pH=5.5的酸性环境，atpE/A、ffh、radA等基因的表达反而呈现下调趋势[21]。同时，在格氏链球菌(Streptococcus gordonii，S.gordonii)中，vicR或vicRK缺失会影响细菌在酸性条件(pH=5.0)下的生长，但仅缺失vicK时，对细菌生长的影响较小[22]。格氏链球菌与变异链球菌都是兼性厌氧菌，敲除vicK基因后的变异链球菌对氧应激的敏感性增高，但敲除vicK基因后的格氏链球菌与野生株表现出类似的表型，只有在vicR或vicRK缺失时，格氏链球菌在有氧环境下的生长速度才明显减慢，且最终的细菌生长量减少至野生株的一半[17，23]。此外，VicRK调控的氧应激与酸耐受可能与精氨酸亚胺酶系统(arginine deiminase system，ADS)相关。vicK基因失活可导致变异链球菌对渗透压敏感性的增加[21]，表明 VicRK TCS也参与调节细胞渗透保护的过程。

4 VicRK TCS调控细胞脂肪酸代谢的作用机制

脂质双分子层是细菌生物膜的重要组成部分，脂肪酸的代谢影响生物膜的流动性和渗透性。VicRK TCS在多种细菌中参与脂肪酸的代谢。在金黄色葡萄球菌中，等位基因突变株SAM1010(yycF1)对长链不饱和脂肪酸的敏感性高于野生株[24]。在枯草芽孢杆菌中，VicRK对膜磷脂去饱和酶具有间接调控作用,可抑制yocE(des) 基因(编码脂肪酸去饱和酶)的表达[5]。诱导肺炎链球菌中的vicR或敲除vicK影响脂肪酸转录相关基因的表达，譬如，用麦芽糖在vicK敲除株中诱导vicR过表达时，12个fab基因的表达改变且7个脂肪酸合成基因上调，肺炎链球菌膜的直链、16和 18碳饱和及不饱和脂肪酸的占比发生变化。纯化的非磷酸化VicR蛋白和FabTH-acp操纵子的启动子体外结合实验[25]进一步证实VicR可直接抑制FabT阻遏物转录，且发挥转录调控作用的是非磷酸化状态的VicR。

5 VicRK TCS调控细胞免疫功能的作用机制

如何对抗宿主的免疫系统也是细菌生存至关重要的一环。在肺炎链球菌及化脓性链球菌中，VicRK可通过简化表面蛋白的表达，从而逃避口腔黏膜和唾液腺的上皮、口腔液和淋巴组织的树突细胞、巨噬细胞和多形核白细胞(polymorphonucleocyte，PMN)等宿主免疫细胞的吞噬作用[26]。在变异链球菌中，敲除vicK使得细菌对补体C3b沉积的敏感性降低，与血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的结合率低，进而导致C3b/IgG介导的PMN的调理吞噬作用减弱。在vicK敲除株中，补体推定肽酶的基因(pepO和smu.399)在存在血清的环境下上调，在野生株中，这两个基因的缺失显着增强了C3b沉积和调理吞噬的水平。因此，VicRK可能是通过调控肽酶来辅助细菌逃避C3b/IgG介导的PMN调理吞噬作用[27]。

6 VicRK TCS调控细菌致病性的作用机制

生物膜是金黄色葡萄球菌在机体的重要生存模式，其形成与VicRK TCS密切相关。金黄色葡萄球菌形成的生物膜阻碍药物扩散是导致细菌在宿主体内大量繁殖从而引起慢性感染的重要原因。Wu等[28]指出，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)的生物膜量约为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)生物膜量的50%且胞外聚合物的量明显少于后者，生物膜中存在不少“空白”区域[28]。非编码反义核糖核酸(antisense ribonucleic acid，asRNA)可通过碱基配对与目标信使RNA(messenger RNA，mRNA)结合，形成RNA双链体结构，进而抑制相应mRNA的转录或翻译并执行调节功能。过表达antisense vicR RNA抑制vicR mRNA的转录使金黄色葡萄球菌的生物膜形成减少，致病性下降[29]。表皮葡萄球菌及血链球菌作为人体的机会致病菌，生物膜在其致病性方面也发挥着重要作用。表皮葡萄球菌asRNA降低vicR的表达可促使生物膜的量以及胞外聚合物明显下降[30-31]；敲除vicK基因的血链球菌生物膜也下调，可能与生物膜中eDNA的较少有关[32]。

变异链球菌与龋病发生发展密切相关，产酸、耐酸、通过生物膜形式在牙体硬组织表面牢固的黏附力构成其致龋性的三大要素。葡聚糖是变异链球菌生物膜细胞外基质的主要成分，可分为胞内多糖和胞外多糖。变异链球菌通过葡糖基转移酶(由gtfB、gtfC、gtfD基因编码)合成葡聚糖聚合物[33]。其中GtfB主要合成α-1,3糖苷键的水不溶性葡聚糖，GtfD合成水溶性α-1,6糖苷聚合物，而GtfC可同时合成两种类型的葡聚糖产物，但水不溶性葡聚糖占比更大[34]。GtfB/C合成的胞外葡聚糖具有很强的粘性，可促进变异链球菌在牙面的附着，从而促进生物膜的形成。基因芯片及体外启动子结合分析[35]表明，VicR可直接结合到gtfB/C的启动子区域，对其转录进行直接调控。敲除vicK基因时，gtfB/D的表达明显下调，而gtfC未发现明显变化。相对于野生菌株，突变株形成的生物膜粗糙，呈块状，容易破裂且松散。而过表达vicRK时，gtfB/C/D以及gbpB(葡聚糖结合蛋白)的表达都上调，形成的生物膜虽然较为粗糙，但是相对致密[34]。VicK的磷酸酶活性对变异链球菌的致病性也有重要作用。当通过关键氨基酸的点突变阻断VicK的磷酸酶活性时，gtfB/C以及gbpB明显下调，而gftD上调，形成的生物膜同样疏松易被破坏[4]。过表达变异链球菌中antisense vicR RNA抑制VicR mRNA的转录，细胞生物膜量明显下降且细胞外基质形成减少[36-38]。既往研究[39]还发现，患龋儿童口腔内提取的变异链球菌antisense vicR RNA表达水平低于未患龋儿童，表明过表达antisense vicR RNA的变异链球菌致龋性降低。vicX与vicRK同属于一个启动子基因，作为三反子操纵子，vicX对gtfB/C/D也有调控作用。敲除vicX基因时，gtfB/C明显上调，且生物膜比野生型更为致密[40]。

此外，VicRK还影响细菌对抗生素的应答。在磷霉素、万古霉素等抗生素的刺激下，枯草芽孢杆菌VicRK的表达水平提高[19]。耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)的产生也和VicRK存在密切关系， YycHI可调节金黄色葡萄球菌YycGF(VicRK)蛋白，YycHI的突变诱使YycGF(VicRK)活性下调，进而降低了细菌对万古霉素的敏感性[41]。

7 结语

VicRK TCS影响细胞分裂、细胞自溶、环境应激、脂肪酸合成、免疫调控、生物膜形成等，对革兰氏阳性菌的生存和致病性至关重要。因此，VicRK蛋白有望成为抑制致病菌的重要靶点之一。抑制VicK的激酶活性或磷酸酶活性、诱导过表达antisense vicR RNA等抑菌方式被相继提出，为MRSA引起的顽固骨髓炎、肺炎链球菌引起的肺炎及变异链球菌引起口腔龋病等疾病的防治提供了新思路。