海豚链球菌LAMP方法的建立及初步应用

张永德　冯世文　李军

摘要：为快速准确地检测鱼类海豚链球菌（Streptococcus iniae），减少由其造成的经济损失，建立了一种基于Sim基因高效、敏感的海豚链球菌环介导等温扩增（LAMP）检测技术，并对739個样品进行了检测。结果表明，该方法可以特异性地检测海豚链球菌，而不能检测无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）等8种参考菌株。对海豚链球菌DNA最低检测限为5.32拷贝/μL；对739个样品的检测结果显示，8种鱼类海豚链球菌的平均检出率为17.67%，池塘水和海水的检出率分别为13.33%、16.67%；该菌主要发现于罗非鱼脑组织中，其平均检出率为27.04%（43/159），而其他鱼类则主要发现于皮肤，平均检出率为24.14%（42/174）；阳性样品主要来自于2014年6月至9月期间，占总检出率的65.00%。

关键词：海豚链球菌（Streptococcus iniae）；链球菌病；环介导等温扩增技术；罗非鱼

中图分类号：S852.61 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）15-0099-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.15.025 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Development and Preliminary Application of Loop-mediated Isothermal Amplification （LAMP） Method for Rapid Detection of Streptococcus iniae

ZHANG Yong-de1，FENG Shi-wen2，LI Jun2，PENG Hao2，LIANG Wan-wen1，YU Yan-ling1，LI Ming1，

YANG Xue-ming1，ZHU Jia-jie1，LUO Hong-lin1，CHEN Fu-yan1，LEI Ai-ying1

（1. Guangxi Key Laboratory for Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture/Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning 530021， China； 2. Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Nanning 530001， China）

Abstract： To develop a rapid and accurate method for detecting Streptococcus iniae and limit the losses because of this disease， a loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay was established with four specific primers designed according to the Sim gene of Streptococcus iniae in GenBank， and totally 739 samples were collected and detected by LAMP. The results showed that the LAMP had a high sensitivity for S. iniae with detection limits of 5.32 copies/μL S. iniae DNA. The LAMP method had a strong specificity， which can be specifically amplified S. iniae， and no amplifications were observed in the 8 reference strains. The detection results of 739 samples showed that the average detection rate of S. iniae in the samples from 8 species of cultured fish was 17.67%， while 13.33% and 16.67% were from pond water and seawater， respectively. The bacteria were found mainly in tilapia brain tissues， and the average positive detection rate was 27.04%， while in other fishes， the average positive detection rate was 24.14%. Higher S. iniae positive carrying rate during Jun to Sep， 2014 was found comparing to Jan to May and Oct to Dec， 2014， with the detection rate reached to 65.00%.

Key words： Streptococcus iniae；streptococcosis；loop-mediated isothermal amplification （LAMP）；tilapia

链球菌病是一种细菌性疾病，对多种鱼类如亚洲石斑鱼、鲈鱼、银鲳、日本比目鱼、红鼓鱼和罗非鱼等造成严重的影响[1-3]。据估计，全球鱼类每年由链球菌造成的经济损失约2.5亿美元。目前，发现可引起鱼类链球菌病的链球菌亚种主要有无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）、副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae），其中，海豚链球菌和无乳链球菌已成为鱼类，特别是罗非鱼链球菌病的主要病原[4-6]。在中国，2001—2006年罗非鱼链球菌病只是个别养殖场偶发，累计死亡率只有5%～15%。然而从2009年开始，罗非鱼链球菌病大规模爆发，并伴随30%～80%的高死亡率，仅2011年造成的经济损失就高达约4亿美元。尽管海豚链球菌和无乳链球菌都可引起罗非鱼链球菌病，但其优势菌群可能在不同的时期会改变。Chen等[7]发现，中国2006和2007年流行的主要菌群为海豚链球菌，占总检出率的94.7%，2009和2011年则变为无乳链球菌，占总检出率的97.7%。尽管目前无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原，但自2009年链球菌优势菌群改变以来，海豚链球菌是否仍是中国鱼类的潜在养殖风险仍未知。

海豚链球菌可以感染至少27种重要的海洋和淡水鱼类。感染鱼类经常发生脑膜脑炎和败血症，死亡率高达30%～50%[8]，海豚链球菌已成为水产养殖最严重的病菌之一。此外，海豚链球菌还是机会性人畜共患病原，可通过带菌鱼感染人类[9]，鱼类或水环境中海豚链球菌的传播会增加人类公共卫生的风险。由于海豚链球菌与无乳链球菌、副乳房链球菌、停乳链球菌等链球菌在细菌形态和染色上极其相似，通常，生化试验是检测海豚链球菌的主要手段，但其过程大约需要1～2 d[10]。PCR、核型分型、RAPD和PFGE[11-13]等也可用于海豚链球菌检测，然而这些方法也比较耗时，并且可能由于检测过程中多次添加试剂而导致污染。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种敏感、快捷、低成本的检测方法，其扩增可在1 h内完成，通过荧光染料的浊度或颜色变化即可检测产物[14]，检测时间大幅缩短。因此，本研究建立了1种基于海豚链球菌Sim基因检测的高效、敏感的LAMP检测方法，并对部分鱼类海豚链球菌的感染状况进行了检测，以期为这方面研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 细菌菌株及待检样品

以临床分离和鉴定的9株海豚链球菌进行LAMP方法的构建，以广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室鉴定和保存的无乳链球菌、副乳房链球菌、停乳链球菌、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、气单胞菌（Aeromonas veronii）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）、哈氏弧菌（Briohatveyi）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）作为参考细菌。细菌于28 ℃下在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或血琼脂中培养。从广西、广东和云南收集了739个淡水鱼、海水鱼样品以及海水、池塘水样品用于海豚链球菌的检测（表1）。

1.2 主要试剂

细菌全基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Loopamp DNA扩增试剂盒购自荣研生物科技公司；SYBR Green I购自Invitrogen公司；Bst DNA聚合酶、2×Taq Plus PCR MasterMix、DNA Marker等均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据海豚链球菌Sim基因序列（EU287919.1-EU287923.1），采用Primer Explorer 4.0软件（http： /primerexplorer.jp/lamp）设计海豚链球菌的LAMP引物。其中，F3（5′AAGCAGATTTGGAACAAGC3′）和B3（5′TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCT3′）分别为外侧上、下游引物，FIP（5′TCTGCCAATTGTTTTTGAAG TTCAGTGCACGAGAATTAGATACGC3′）和BIP（5′AACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCT TAGCCGCT3′）分别为内侧上、下游引物。然后采用F3和B3进行常规PCR扩增，以对比LAMP技术的灵敏度和特异性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 细菌基因组DNA的提取

将海豚链球菌和参考细菌接种到TSB中过夜培养；脑组织取10 mg于0.9 mL PBS中清洗，在无菌研钵中研磨；皮肤和腮组织首先接种到血琼脂平板上培养，然后取其菌落在TSB中培养。将上述样品各取10 mL，采用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，将DNA浓缩至1.7×102 ng/μL（约5.32×1010 拷贝/μL）。将池塘水与海水离心，进行细菌沉淀，提取DNA后用于LAMP和PCR检测。

1.5 LAMP反應检测

采用Loopamp DNA扩增试剂盒进行LAMP反应，LAMP反应体系为25 μL，包括2×Reaction Mix 12.5 μL、FIP和BIP各1 μL（40 pmol/μL）、F3和B3各1 μL（50 pmol/μL）、钙黄绿素25 μmol/L、Bst DNA聚合酶1 μL、1.7×102 ng/μL基因组DNA 2 μL。LAMP反应在Eiken LA-320C实时浊度计中进行，每6 s读取OD400 nm值，在63 ℃测定60 min，然后在80 ℃灭活5 min。以去离子水替代DNA模板作为阴性对照。

1.6 PCR扩增检测

使用引物F3和B3对海豚链球菌进行PCR检测，25 μL PCR反应体系包括12.5 μL PCR master Mix，F3和B3引物各1 μmol/L，1.7×102 ng/μL基因组DNA 2 μL。PCR扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 LAMP检测的特异性

以携带Sim基因的海豚链球菌菌株作为阳性对照，去离子水作为阴性对照，以副乳房链球菌、停乳链球菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、气单胞菌、爱德华氏菌、哈氏弧菌和创伤弧菌共8株鱼类常见感染细菌作为参考菌株，在63 ℃下扩增40 min，观察LAMP对海豚链球菌检测的特异性，所用的DNA为从海豚链球菌和参考细菌提取的1.7×102 ng/μL的DNA。LAMP扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，采用DNAStar 7.10中的ClustalW软件将序列与GenBank数据库中的海豚链球菌Sim基因序列比对分析。

1.8 LAMP检测的灵敏性

将海豚链球菌DNA进行连续10倍稀释，稀释后的浓度范围为5.32×1010～5.32×100拷贝/μL。然后采用优化的LAMP和PCR方法分别对其进行检测，并比较其检测灵敏度。

1.9 LAMP扩增标准曲线的建立

将海豚链球菌DNA连续10倍稀释为5.32×1010～5.32×100拷贝/μL共11个浓度梯度，用作LAMP测定的标准模板，采用F3和B3引物进行LAMP扩增。当浊度为0.1时，由于DNA浓度的负对数与浊度之间存在线性关系，可以通过记录浊度和时间点来绘制标准曲线，并通过LAMP扩增标准曲线确定细菌拷贝数。

1.10 海豚链球菌LAMP检测方法的应用

对从广西、广东和云南省收集的739个样品进行细菌分离培养，提取DNA，利用LAMP技术进行海豚链球菌检测，并分析不同鱼类、池塘水及海水中海豚链球菌的携带情况，不同时间段鱼类海豚链球菌的感染率，以及海豚链球菌在鱼体内不同组织的分布情况。

2 结果与分析

2.1 LAMP检测的特异性

LAMP检测的特异性结果见图1。从图1中可以看出，仅以携带Sim基因的海豚链球菌作为模板出现浊度曲线，而阴性对照和参考菌株则均无浊度曲线。结果表明，采用引物对FIP和BIP检测海豚链球菌具有高度的特异性。LAMP扩增产物经测序，序列比对分析后发现，该序列与海豚链球菌Sim基因序列相似度达100%。

2.2 海豚链球菌LAMP检测的灵敏性

LAMP检测灵敏度研究结果显示，LAMP对海豚链球菌DNA检测的最低浓度为5.32拷贝/μL（图2）。11个DNA浓度梯度，LAMP检测反应所需的孵育期分别为16、18、20、22、23、26、30、35、40、41、45 min，最早检测到海豚链球菌存在的时间小于30 min。PCR检测结果显示，其检测的最低浓度为5.32×102拷贝/μL（图3）。

2.3 LAMP扩增标准曲线的建立

使用11个浓度梯度的海豚链球菌基因组DNA作为模板进行LAMP扩增，并构建LAMP扩增标准曲线，标准曲线为Y=0.483 4X-10.416，相关系数R2为0.996 8。其中，X表示LAMP反应所用的时间段，Y表示海豚链球菌DNA浓度的负反对数（图4）。

2.4 海豚链球菌LAMP检测方法的应用

对收集到的739个样品进行海豚链球菌检测，其中罗非鱼样品299份，占总样品量的40.5%，其他鱼类样品380份，占总样品量的51.42%。LAMP检测结果（表2）显示，8种鱼类海豚链球菌平均检出率为17.67%，其中罗非鱼样品平均检出率为20.40%，高于其他7种鱼类的15.53%。而在健康罗非鱼、池塘水和海水样品中也检测到海豚链球菌，其检出率分别为10%、13.33%和16.67%。

2.4.1 海豚链球菌感染阶段分析 采用LAMP法对所有样品进行检测并分析样品所处的阶段，结果见表2。从结果可以看出，海豚链球菌阳性样品主要来自2014年6月至9月期间。在健康罗非鱼中，3个阳性样品均处于此期间，而来自广西、云南和广东省的患病罗非鱼样品中，海豚链球菌在此期间的阳性检出率分别占其总阳性率的90.00%（9/10）、65.38%（17/26）和53.33%（8/15），平均为50.98%，在无症状的罗非鱼中，57.14%（4/7）的阳性样品来自该时期。其他7种鱼类，与2014年1—5月和10—12月两个阶段相比，均发现海豚链球菌阳性携带率在6—9月最高。

2.4.2 海豚链球菌在鱼体内的组织分布 海豚链球菌在鱼体内的组织分布检测结果见表2，在所检测的罗非鱼中，该菌主要发现于脑组织中，其阳性检出率为27.04%（43/159），然后依次为腮和皮肤，其阳性率分别为15.09%（8/53）和11.49%（10/87）；而其他7种鱼类则主要发现于皮肤，其平均阳性率为24.14%（42/174），其后依次为腮和脑，平均阳性率分别为12.50%（10/80）和5.56%（7/126）。

3 讨论

Chen等[7]的认为，引起中国罗非鱼严重链球菌病的主要病原由海豚鏈球菌变为无乳链球菌，而病原突然变化的确切原因目前尚不清楚，推测中国南方2008年发生的寒灾可能会对这种变化有重大影响，然而这一推断并未得到充分证明。尽管目前链球菌病的主要病原为无乳链球菌，但海豚链球菌是否仍有可能恢复爆发并成为鱼类疾病的风险尚不可知。本研究建立的LAMP测定方法，可特异性检测海豚链球菌Sim基因，最早检测海豚链球菌的时间小于30 min，同时，LAMP技术检测Sim基因也是高度灵敏的，在纯培养物中可检测到最低浓度为5.32拷贝/μL的基因组DNA，比PCR方法灵敏度高100倍，这为开展海豚链球菌大规模调查研究提供了可能。此外，LAMP检测不需要凝胶电泳和训练有素的试验人员，大大节省了试验材料和人力。

结果表明，罗非鱼比所研究的其他7种鱼类更易感染海豚链球菌。罗非鱼海豚链球菌平均阳性检出率为20.40%，高于其他鱼类（海鱼和淡水鱼）的15.53%，而来自云南的罗非鱼感染海豚链球菌的比率在所检测的鱼类中最高，为32.91%，比罗非鱼平均感染率高12.51个百分点。这一现象可能是由于2008年寒灾期间，云南省几乎未受寒灾的影响，海豚链球菌存活下来的比中国南方其他地区多造成的。同时还发现，与其他时间段相比，2014年6月至9月期间海豚链球菌检出率更高，而此期间中国南方地区的平均水温为28～35 ℃，也符合链球菌在高温条件下容易爆发的规律。组织分布研究结果显示，鱼类的脑和皮肤是海豚链球菌感染的主要部位。鉴于大脑是海豚链球菌的侵入点，因此大多数鱼类在海豚链球菌感染后表现为脑膜脑炎和败血症[8]。

尽管目前已经建立了3种检测海豚链球菌的LAMP方法，其检测的目的基因分别为lctO[15]、 pgm[16]和soda[17]，但尚未发现针对Sim基因并应用于海豚链球菌检测的LAMP方法。Sim基因是一种纤维蛋白原结合的M样蛋白编码基因，在感染海豚链球菌后避免宿主巨噬细胞的氧化攻击中发挥重要作用[18]，该基因可能作为一种主要的毒力因子[19，20]，有助于抗血清杀伤和吞噬逃避[21，22]。因此，该基因的存在可能意味着存在一种感染性海豚链球菌。本研究采用以Sim为目的基因的LAMP测定技术，对中国南方部分魚类感染海豚链球菌的情况进行了检测，发现罗非鱼、鲈鱼、小黄鱼、大黄鱼、红鲷鱼、黄颡鱼、鲶鱼和尖吻鲈鱼等都存在海豚链球菌感染，这意味着海豚链球菌可在这些鱼类之间相互传播。有研究显示，海豚链球菌感染的鱼类可通过粪便释放细菌，再次感染健康的鱼类[23]，或感染海豚链球菌死亡的鱼类被用来饲喂其他鱼类[3]，从而导致该病菌的传播或链球菌病爆发。虽然本研究中未观察到海豚链球菌病的爆发，但所检测鱼类及养殖水体较高的海豚链球菌携带率意味着这些地区的鱼类仍存在较高的发病风险。本研究建立的一种基于Sim基因的LAMP检测方法，具有特异性强、灵敏、快速且成本低的优点，对739个样品的检测显示出了良好的应用效果，具有作为鱼类海豚链球菌病调查应用的良好前景。

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