三化汤治疗缺血性脑卒中的机制探讨

王娟，王廷华，白雪

1 西南医科大学附属中医医院 四川泸州 646000 2 四川大学华西医院 四川成都 610041

脑卒中是世界上最普遍的血管疾病，具有较高的发病率、致残率、病死率，给社会、政府及家庭带来了巨大的负担。脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，前者是由大脑内部血管破裂引起的，缺血性中风是由血管堵塞引起的，这两种情况都会导致大脑局部组织缺氧。虽然这两种中风都很严重，很普遍，但研究表明，缺血性中风更常见，占中风总数的87%[1]。血脑屏障（blood brain barrier，BBB）是大脑和外周循环之间的重要屏障，通过严密调节物质交换在维持中枢系统内环境稳态中起着至关重要的作用。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）可引起BBB损伤及破坏，进一步促进缺血性脑损伤的发展[2-3]。研究表明，缺血性脑卒中患者血脑屏障的破坏可能与TJ蛋白破坏、MMPs、AQP-4 基因和蛋白、VEGF的表达上调、免疫炎症级联反应被激活，大量炎性细胞因子和趋化因子释放，破坏血脑屏障的内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞，导致血脑屏障的损伤[4]。

缺血性脑卒中属于祖国医学“中风”范畴，总结中风发病机理，不外乎气机逆乱、脑脉痹阻、络破血溢、损脉及脑[5]。金代医家刘完素提出“脑之玄府理论”，刘完素认为五官、四肢百骸、意识等功能的正常皆依赖于玄府开通、气机升降出入的通利，若玄府密闭则会导致各种疾病的发生，脑之玄府闭塞是缺血性中风的发病关键，故治疗中风注重宣通玄府[6]。现代研究表明玄府理论与血脑屏障 （bIood brain barrier，BBB）在结构和功能方面存在着许多共性内涵。三化汤主要由大黄、厚朴、羌活、枳实四味药物组成，是开通玄府治疗中风病之名方，具有宣行气血、通腑开结、调畅气机、开通玄府的作用[7]。本文主要通过网络药理学的知识，探究三化汤开通玄府法调节血脑屏障治疗缺血性脑卒中的作用机制。

材料与方法

1 三化汤活性成分和成分靶点的收集、转换

在传统中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology：TCMSP）（https：//tcmspw.com/index.php）以“大黄、厚朴、羌活、枳实”成分为关键词搜索各成分的所有化学成分，以吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数中的OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3及BBB＜0.3为筛选条件，得到三化汤主要作用于中枢神经系统及外周的化学活性成分。并应用SwissTargetPrediction数据库检索三化汤各单味药化学成分对应的靶点并加以整合、去重、取并集后，即为各成分靶点库。

2 成分靶点蛋白转化为基因名称

在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）将搜询得到的靶点蛋白名称按顺序逐一键入搜索框中搜索得到其对应基因名称（Gene names）。

3 缺血性脑卒中靶点获取

应用GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）与 DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），在 搜索框中输入关键词：“ischemic stroke、 Cerebral arterial thrombosis、 Cerebral arterial thrombosis、 stroke 、cerebral infarction ”进行搜索，挖掘缺血性脑卒中相关靶点。

4 “活性成分·潜在靶点”网络构建与分析

按照BBB≥0.3及BBB＜0.3将筛选出的三化汤化学活性成分对应的靶点和疾病靶点应用Venny2.1数 据 库（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出交集靶点。

5 关键靶点蛋白相互作用（PPI）网络的构建与分析

将共同潜在靶点导入 STRING11.0 数据库（https：//string-db.org/）构建 PPI 网络图（设置条件：蛋白质种类 “homo sapiens（人类）”，作用阈值 “medium confidence（0.400）”）。通过Cytoscape（Version 3.7.1）软件，进行可视化网络处理，得到三化汤活性成分-靶点网络图。以同样的方法得到缺血性脑卒中的疾病-靶点网络图。应用Cytoscape（Version 3.7.1）软件中的merge设置，将三化汤治疗缺血性脑卒中疾病关键靶点可视图像，对这些重要靶点进行分析。

6 GO分析和KEGG通路分析

通过 Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）数据库，对靶点生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）进行GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析，并采用线上绘图工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）将富集结果可视化。

7 分子对接验证

通过TCMSP数据库中获得三化汤中活性成分的PubChem号，输入PubChem在线数据库平台（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出各活性成分小分子配体3D结构，并使用Openbable软件将格式转化为Mol2格式，导入AutoDock tools（1.5.6）进行加氢离子，计算电荷数目，合并非极性氢后保存为pdbqt格式；在PDB在线数据库平台（https：//www1.rcsb.org/）中搜索出药物核心靶点蛋白受体，通过Pymol软件去除蛋白受体结构的溶剂和水分子，将其导入Auto Dock Tools 1.5.6软件进行同样的处理，根据每个受体蛋白结构的不同，定义不同的Grid Box盒子；运用分子对接技术，对其活性成分的受体与配体进行匹配，分析其结合能力，选取每个药物配体结合能最低的结合能，保存文件，将其导入Pymol软件进行对接结构可视化。

结果

1 三化汤成分的筛选及其成分靶点

OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3的药物成分共12种（见表1），其中大黄3种，厚朴1种，羌活8种，枳实2种；其对应的靶点共131个，其中大黄43个，厚朴26个，羌活46个，枳实17个，通过Unipot数据库和perl软件对蛋白名称进行标准注释化并删除重复靶点，筛选得到的靶点共59个。

表1 三化汤主要的潜在活性成分（BBB≥0.3）

OB≥30%、DL≥0.18、BBB＜0.3的化学成分30种（见表2），其中大黄7种，厚朴1种，羌活5种，枳实17种；其对应的靶点共185个，其中大黄41个，厚朴7个，羌活17个，枳实120个，删除重复靶点后最终得到134个靶点。其中大黄的Mutatochrome（β胡萝卜素氧化物）、Sennoside E（番泻苷E）、Sennoside D（番泻苷D），羌活的coumarin，glycoside（香豆素糖苷），枳实的Obacunone（黄柏酮）无法在SwissTargetPrediction数据库查询到对应靶点，这些成分查阅文献单独分析：β胡萝卜素是一种重要的天然色素，对人体健康十分有益。它广泛存在于蔬菜和水果中。三种主要功能是抗氧化作用、细胞间隙连接相关功能和免疫相关功能。由于它的多种功能，β -胡萝卜素被认为可以预防和治疗许多慢性病。胃癌是其可治疗的重要疾病之一[8]。番泻苷（sennoside）包括番泻苷 A、B、C、D、E、F、G 等，具有泻下、抗菌活性、保护神经细胞等功能，对大黄进行炮制的过程中无论是清蒸、酒蒸还是酒炙，番泻苷含量均有所下降，番泻苷D、E含量更少，且研究甚少[9]。香豆素糖苷是合成香料、医药、染料及 农药的重要中间体，香豆素还具有植物生长调节，光敏，抗菌、抗病毒，松弛平滑肌，抗血凝等生物活性[10]。黄柏酮具有多种药理作用，其中对肿瘤的治疗作用倍受关注，研究表明，黄柏酮在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种癌症中具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，但它对血管平滑肌细胞的增殖和迁移的影响仍不清楚[11]。

表2 三化汤主要的潜在活性成分（BBB＜0.3）

利用 Cytoscape3.7.2绘 制“药 物-成分-靶点”网络图（图1），其中BBB≥0.3共有75 个节点、154 条边（图左），根据Degree值及靶点数前三的化合 物 分 别 是beta-sitosterol（degree=40）、Eucalyptol（degree=27）、及Ammidin（degree=18）。BBB＜0.3共有167 个节点、409 条边（图右），根据Degree值及靶点数前三的化合物分别是luteolin（degree=58）、naringenin（degree=38）、及nobiletin（degree=37）。（节点代表作用靶点；边表示靶点之间的联系强度）。

图1 药物-活性成分-靶点相互作用网络图（BBB≥0.3（图左）、BBB＜0.3（图右））

2 三化汤与缺血性脑卒中共同潜在靶点的筛选

疾病与药物交集靶点（图2）。结果显示，“三化汤-缺血性脑卒中”共同靶点有72个，其中易透过血脑屏障与缺血性脑卒中共26个，不易透过血脑屏障与缺血性脑卒中共同潜在靶点63个。

图2 疾病与药物交集靶点

3 构建PPI网络，筛选核心靶点

将三化汤与缺血性脑卒中共同潜在靶点导入STRING数据库，获得靶蛋白之间的相互作用关系，再将靶蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.7.2软件中（图3）。

图3 蛋白互作图：BBB≥0.3（图左）、BBB＜0.3（图右）

利用“Analyze Network”功能对PPI网络进行拓扑分析，计算出各节点的度值degree；当BBB≥0.3，共有26个节点，64条边，平均自由度为4.92，筛选出符合degree≥4.92共有13个，即为三化汤易透过血脑屏障成份治疗缺血性脑卒中的关键靶点（见表3），将前3个靶点作为核心靶点，即CASP3、PTGS2和JUN。BBB＜0.3，共有63个节点，823条边，degree的中位数为26.12，筛选出符合degree≥26.12共有33个，即为三化汤不易透过血脑屏障成份治疗缺血性脑卒中的关键靶点（见表4），按照度值对关键靶蛋白进行排序，将前3个靶点作为核心靶点，即TNF、IL6和VEGFA。

表3 三化汤治疗缺血性脑卒中关键靶点（BBB≥0.3）

表4 三化汤治疗缺血性脑卒中关键靶点（BBB＜0.3）

4 GO富集分析及KEGG富集分析

为了阐明三化汤治疗缺血性脑卒中的作用机制，我们对三化汤治疗缺血性脑卒中关键靶基因进行GO功能及KEGG通路富集分析。

结果表明，BBB≥0.3，在生物过程方面，主要涉及：细胞对有机环化合物的反应、对脂多糖的反应、细胞对氮化合物的反应、血液循环、对异源生物刺激的反应、血管发育、细胞分泌等；在细胞组分方面，主要涉及膜筏、突触前膜、小窝、血液微粒、黏着斑等；在分子功能方面，主要涉及凋亡、G蛋白偶联胺受体活性、肽酶活性、核受体活性、蛋白质同二聚活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白酶结合、血红素结合、丝氨酸水解酶活性、磷酸酯水解酶活性等。以q值为筛选依据，绘制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 气泡图（见图 6）。

图4 BBB≥0.3 BP 、 CC、MF气泡图

图5 BBB＜0.3 BP、CC、MF气泡图

图6 KEGG通路富集分析气泡图

BBB＜0.3时，在生物过程方面，主要涉及：对脂多糖的反应、氧化应激反应、凋亡信号通路、炎症反应的调节、肌肉细胞增殖、对多肽的反应等；在细胞组分方面，主要涉及膜筏、细胞外基质、转录调节复合物、谷氨酸能突触等；在分子功能方面主要涉及：细胞因子受体结合、RNA聚合酶II特异性dna结合转录因子结合、MAP激酶活性、血红素结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白酶结合、多肽结合、内肽酶活力等。以q值为筛选依据，绘制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 气泡图（见图7）。

图7 KEGG通路富集分析气泡图

BBB≥0.3，KEGG通路分析主要涉及：与钙离子相关通路、cAMP信号通路、VEGF信号通路、胆碱能突触通路、5-羟色胺通路等；以q值为筛选依据，绘制KEGG气泡图（见图8）。

BBB＜0.3时，KEGG通路分析主要涉及：IL-17 信号通路、动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、炎症介质对TRP通道的调节；以q值为筛选依据，绘制KEGG气泡图（见图9）。

5 分子对接结果

一般认为，当结合能＜0kcal·mol-1时，认为分子蛋白质自发结合并相互作用，而且结合能越低，分子构象越稳定。若结合力＜-5.0 kcal·mol-1，表明两者具有较好的结合性，结合力结果见表5。

BBB≥0.3，经筛选，靶点数前三的主要活性成分是：植物固醇（beta-sitosterol）、欧前胡素（Ammidin）、 桉树脑（Eucalyptol），degree 值前三的靶点是CASP3、PTGS2和JUN，从上述化合物与交集靶点的分子对接结果（见表5）中不难发现，植物固醇与PTGS2（PDB ID：5F19）、欧前胡素与CASP3（PDB ID：1NME）、桉树脑与 PTGS2（5F19）均具有良好的结合活性。植物固醇可与活性位点附近的 ASN-537、VAL-228、GLY-533 三种氨基酸形成氢键结合到PTGS2、 欧前胡素可与 MET-44、GLY-45、GLU-84 三种氨基酸形成氢键结合到 CASP3、桉树脑可与 ARG-44、HIS-39L两种氨基酸形成氢键结合到PTGS2上（见图 10）。

BBB＜0.3，靶点数前三的主要活性成分是：木犀草素（Luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陈皮素（nobiletin），degree 值前三的靶点是TNF、IL6和VEGFA，从上述化合物与交集靶点的分子对接结果（见表5）中不难发现，木犀草素与IL6（PDB ID：1ALU）、柚皮素与TNF（PDB ID：2AZ5）、川陈皮素与VEGFA（1MKK）均具有良好的结合活性。木犀草素可与活性位点附近 的 LYS-86、LYS-66、GLU-93、LEU-62、ASN-61四种氨基酸形成氢键结合到IL6、柚皮素可与 GLN-125、ASN-92两种氨基酸形成氢键结合到TNF、川陈皮素可与 CYS-102、CYS-104两种氨基酸形成氢键结合到VEGFA上（见图11）。

讨论

目前，缺血性脑卒中的发生主要是由各种原因引起的脑组织血流供应骤减，脑组织缺血、缺氧、坏死，引起的一系列神经功能障碍、内皮细胞凋亡或坏死，脑血管结构改变，血脑屏障功能破坏[12-13]。涉及机制主要有：兴奋性氨基酸损伤学说、炎症反应学说、氧自由基学说、神经细胞凋亡学说、血流动力学改变学说[14]。血脑屏障的损伤是脑缺血再灌注损伤的病理生理基础，缺血性脑中风发病后，血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）的完整性受到破坏，通透性改变；研究表明，急性低压低氧可导致大鼠脑组织细胞空泡化增多、水肿明显，胶质细胞增生显著，影响了AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表达，增加低压低氧下血脑屏障的通透性[15]。故保护血脑屏障完整性是中枢神经系统发挥生理功能的重要保证。

《素问·水热穴论》曰：“所谓玄府者，汗孔也”。刘完素认为：“玄府：无物不有，乃气升降出入运行之道路门户也，广泛存在于机体五官九窍、脏腑内外的微观、玄妙孔窍，与经络、腠理、三焦、脏腑等共同构成运行机体精、气、血、津、液等的循环通道，强调了玄府的“广泛性、微观性、开阖性和通利性”，它与血脑屏障在结构和生理上具有高度相似之处[16]。血脑屏障与玄府皆为人体结构层次及功能系统中最为细小的单位，肉眼不可见，分布广泛。血脑屏障人体血液与脑组织液进行物质交换的重要保护屏障系统，是各种离子通道及水通道蛋白的整合体，调控气血周流，与玄府流通气液、渗灌气血的作用相似。在病理状态下，玄府闭塞，气血、津液出入门户不通，气机阻滞，风、火、痰浊、淤血、湿邪等邪实阻滞与脑，神机实用，则产生意识功能障碍；脑血管疾病下损害血脑屏障，物质交换屏障功能受损，有害物质进入大脑，引起脑水肿或脑肿胀。研究表明，开通玄府法可改善大鼠卒中后脑水肿及改善神经功能，调节缺血再灌注损伤时AQP4 mRNA的异常表达[17]。

“玄府闭塞”是中风病关键发病机制，中风病病位在脑，高巅之上，唯风可到，三化汤方用羌活以化风，厚朴、大黄以化滞，枳实以化痰，故曰三化，活用小承气通腑泻热，巧用羌活解风邪阻络之标，使内外相合，升降并济，以解中风病玄府闭塞之要[18-20]。

利用网络药理学方法筛选出欧前胡素、木犀草素、柚皮素、川陈皮素等 42 个主要活性成分，可通过抗炎、抗细胞凋亡、保护血管内皮等作用抑制 IS 的发生发展。CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA作为核心靶点。Caspase-3是神经元细胞凋亡的关键介质[21]，缺血性脑卒中可激活caspase-3，导致细胞损伤和死亡[22]，研究表明，急性缺血性脑卒中患者血清caspase-3的表达水平显著增高，神经功能发生障碍[23]。受多种炎性细胞调节而高度表达，可抑制核转录因子-κB通路，进一步抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移[24-25]。JNK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenac tivated-proteinkinase，MAPK）家族成员，参与了细胞生长、增值、凋亡等过程，脑损伤前期，大脑释放IL6、TNF等炎性因子，JNK的激活与炎症因子密切相光，从而引发下游蛋白c-JNK磷酸化，促进凋亡，同时可启动Caspase-3，进一步促进神经元细胞凋亡；研究表明Jun还可以促进了大鼠CNS神经元和小鼠DRG神经元的突起生长[26-27]。IL6、TNF是一种促炎因子，研究表明，急性缺血性脑卒中患者的IL6、TNF的表达显著增高，介导白细胞浸润为主的急性炎性反应，与内皮细胞损害、血脑屏障通透性改变、动脉粥样硬化、血管闭塞等多种损害有关[28-29]。VEGFA作为一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能促进血管内皮细胞分裂、增殖、迁移以及促进细胞外基质变性、增加血管通透性，还具有促进炎症反应、抗凋亡等作用。研究表明，VEGFA表达上调，促进脑微血管内皮细胞（BMECs）的存活和血管生成[30-32]。

CAMP相关信号通路广泛参与神经元的存活、生长及神经元突触相关物质的合成、传递等环节，能抑制神经细胞凋亡、增强海马神经元再生。研究表明，血管性痴呆大鼠模型中，海马cAMP含量、PKA、pCREB蛋白显著下调，给予药物干预后均可提高cAMP含 量[33-36]。缺血性脑卒中的发生引起兴奋性神经递质的过度释放，使突触后膜处于持续性去极化状态，造成大量Ca2+内流，引发细胞内Ca2+的生化反应，细胞内钙离子紊乱，线粒体内Ca2+超载时，线粒体肿胀、结构裂解，同时激活caspase级联反应，引起细胞凋亡[37-38]。在脑缺血缺氧性疾病中VEGF可通过调节 CBF、促进血管新生、建立侧支循环，发挥改善脑灌注的积极效应；但同时另一方面病理性升高的 VEGF 水平会增强血管通透性和渗漏，并破坏血脑屏障的完整性，促进血脑屏障泄露；VEGF 促进血管新生的同时，其介导的血脑屏障损伤机制，可能是其直接活化 Src，或通过 AKT/eNOS 生成 NO 依赖性介导的亚硝基化，两种途径均激活了 caveolin-1，抑制了 eNOS 活性，在 VEGF/eNOS 途径中形成eNOS/NO/Src/caveolin-1 的负反馈[39-42]。

白介素-17 是一种促炎细胞因子，研究表明，它可以促进细胞增值，分化、凋亡，调控PI3K/AKT/FAS/FASL信号通路抑制Hep-2细胞凋亡，能调控JAK/STAT3信号通路，在喉癌的血管生成中起到重 要[43-44]。IL-17在脑病理状态下，表达含量明细增高，研究表明，会激活NF-κB、JAKs/STATs等信号转导通路，介导一系列炎症反应，使血脑屏障通透性增高[45]。PI3K和AKT具有促进细胞增殖、抗凋亡的作用[46]，PI3K-Akt信号通路可以介导的PPAR γ表达双向调节3T3 - L1细胞的增殖、分化和凋亡，同时AKT可特异性磷酸化内皮一氧化氮氧合酶（endothial nitric oxide synapse，eNOS，介导血管新生与内皮细胞功 能[47-48]。活化的Akt可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，促使核因子NF-κB发生核转位，NF-κB可调控多种炎症因子基因的转录，调控IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等炎症因子，调节炎症反应[49]。活性氧（ROS ）参与了脑卒中的发病，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs ）是ROS起作用的重要靶点，激活PPAR δ清除ROS发挥抗氧化作用，保护神经功能[50]。从分子对接的结果来看，除欧前胡素与JUN的结合效果稍差外，其余各成分与核心靶点都具有良好的结合活性。

本研究通过利用数据挖掘、生信分析等技术，发现三化汤可通过 CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA 等靶点作用于 与钙离子相关通路、cAMP信号通路、VEGF信号通路、胆碱能突触通路、5-羟色胺通路、IL-17 信号通路、动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路等 等多条信号通路，在改善血脑屏障通透性、抗炎、抗氧化、促进血管生成、抑制细胞凋亡等方面发挥保护神经功能的作用，具有多成分、多途径、多靶点的作用特点。但研究也存在不足，如可能遗漏部分生物利用度差但发挥良好作用的活性成分、对接成分偏少等，后期仍需进一步开展细胞、动物等实验进行验证。