基于rbcL序列对猫人参及其近缘种的分子鉴定研究

张晓芹，毛佳乐，王慧玉，雷后兴，蓝 艳

（浙江中医药大学附属丽水中医院，浙江 丽水 323000）

猫人参为猕猴桃科植物对萼猕猴桃（镊合猕猴桃）（Actinidia valvataDunn.）或大籽猕猴桃（Actinidia macrospermaC.F.Liang）的干燥根及粗茎，收载于2015年版《浙江省中药炮制规范》，具有解毒消肿、祛风湿的功效，临床常用于深部脓肿、骨髓炎、风湿痹痛、疮疡肿毒等疾病［1］。药理研究表明，猫人参对胃癌［2-3］、肝癌［4］、肺癌［5］等具有较好疗效，临床应用广泛。

近年来，随着野生猫人参的不断消耗，猫人参资源日益短缺，市场上猫人参混伪品开始出现，以其近缘种较为多见。调研发现市场上常用作猫人参使用的还有黑蕊猕猴桃（Actinidia melanandraFranch.）及中华猕猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）。对萼猕猴桃、大籽猕猴桃、黑蕊猕猴桃为猕猴桃属净果组植物，中华猕猴桃为猕猴桃属星毛组植物，虽然其亲缘关系较近，然而在药理活性上具有较大差异。体外抗肿瘤活性研究表明，对萼猕猴桃和大籽猕猴桃对于胃癌和肺癌具有较好的抑制作用，而黑蕊猕猴桃和中华猕猴桃抑制效果较差［6-8］。因此在临床应用中，应将猫人参与其混伪品进行区分。

有学者基于性状鉴定对猫人参及其近缘种进行了鉴定，认为草酸钙结晶（皮部有亮星）、紫色斑（猫爪印）及根据猫是否爱吃等特点可对猫人参进行物种鉴定［9］，然而该方法依靠经验性较强，且同属其他物种植物也多有此类特征；另有学者采用荧光、紫外、红外、指纹图谱等方法对猫人参及其近缘种进行鉴定［8，10］，但前处理复杂，需要根据猫人参不 同极性提取物分类鉴定，鉴定结果依靠检索表确认，耗时较长；基于脱氧核糖核酸（DNA）条形码的猕猴桃属系统发育学分析表明，猕猴桃属植物可根据其基因序列进行初步区分，然而前期主要对其属内不同亚组的划分规律进行了研究［11］，尚缺乏对猫人参的物种鉴定分析。

叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶基因（rbcL）序列具有易扩增、保守性强、单性遗传、进化路线独立等优点，被广泛应用于药用植物的分子鉴定及系统发育学研究，对于种间植物具有较好的鉴定优势［12-13］。综上，本研究基于rbcL序列对猫人参及其近缘种进行鉴定研究，以期为猫人参的用药安全及质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

微量移液器（德国Eppendorf公司），2-16R离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司），BIO-RAD T100聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）仪（美国伯乐公司），JY-SP型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），NanoDropOne微量核酸定量仪（美国Thermo公司），GenoSens1850凝胶成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司），IMS-50全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）。

1.2 试剂

Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒、Taq酶、DNA分子量标准标记物（Marker）（100～2000 bp）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（5 mmol/L）、5×PCR Buffer、氯化镁（MgCl2）（25 mmol/L）、琼脂糖均购自上海生工生物工程股份有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用试剂均为分析纯。

1.3 材料

同科水东哥属植物水东哥（Saurauia tristylaDC.）的基因序列下载自美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，另外9种猕猴桃属植物为野外采集获得的样品，共计110份，分别来源于浙江丽水市、福建省南平市共计11个采样地点，每个采样点采集叶片10份用于基因序列测定；其余35条用于分析的基因序列下载自NCBI数据库（Genbank）。野外采集样品经丽水市中医院主任中药师林娜鉴定为相应猕猴桃属植物。见表1。

2 方法

2.1 DNA提取

取各样品的新鲜叶片约20 mg，经液氮研磨粉碎后，根据Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒使用说明提取DNA，微量核酸定量仪检测所得DNA质量。

2.2 PCR扩增

PCR扩增引物序列为r-F：5′-ATGTCACCACAA ACAGAGACTAAAGC-3′，r-R：5′-GTAAAATCAAGTC CACCRCG-3′。采用50 μL反应体系：5×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，MgCl24 μL，引物各2 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O补足至50 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环数35；72℃延伸10 min。

2.3 测序分析

扩增产物经1.00%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪检验。PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序分析。每个样品均采用正反双向测序。

2.4 序列比对及ML系统聚类树的建立

DNA序列采用ContingExpress及DNAman软件进行拼接及序列比对，采用Editseq及MEGA-X软件对序列长度、变异位点、保守位点以及碱基组成进行分析，并计算种间及种内遗传距离，构建ML系统聚类树。DNA二级结构采用DNAman软件生成。

3 结果

3.1 rbcL基因扩增结果

扩增产物用1.00%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪检验，110份野生样品均在600 bp左右处出现单一、明亮、清晰的条带。

3.2 rbcL序列分析

除大籽猕猴桃外，同一物种猕猴桃的rbcL序列具有高度保守性，种内差异为0。测序结果进行碱基修正后得到rbcL序列长度约为507 bp。9种猕猴桃样品中鸟嘧啶+胞嘧啶（G+C）含量整体差异较小，为43.39%～44.38%。见表2。

表2 9种猕猴桃科样本rbcL序列碱基组成

3.3 遗传距离分析

9种猕猴桃种间遗传距离为0.0%～1.8%，其中中华猕猴桃、毛花猕猴桃、浙江猕猴桃、长叶猕猴桃的种间以及软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃种间遗传距离为0，对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃种间以及对萼猕猴桃、软枣猕猴桃种间遗传距离最大，为1.8%。见表3。

表3 9种猕猴桃科样本种间遗传距离

3.4 变异位点分析

9种猕猴桃属植物共产生变异位点10个，其中根据195 bp处的胸腺嘧啶（T）碱基可以将猫人参来源物种（对萼猕猴桃和大籽猕猴桃）与另外7种猕猴桃进行区分鉴定，根据182 bp处的腺嘌呤（A）碱基和426 bp处的鸟嘧啶（G）碱基可以将葛枣猕猴桃与其余物种进行区分鉴定，根据227 bp处的T碱基、239 bp处的G碱基和258 bp处的胞嘧啶（C）碱基可以将软枣猕猴桃和黑蕊猕猴桃与其他物种进行区分鉴定。见表4。

表4 9种猕猴桃科样本变异位点分析

3.5 系统聚类树分析

以水东哥属的水东哥rbcL序列为外类群，猫人参及其近缘种的ML系统聚类树见图1。聚类结果表明，葛枣猕猴桃、大籽猕猴桃、对萼猕猴桃聚为一支，其中对萼猕猴桃与本研究采集并测得的大籽猕猴桃序列聚为一支；其余6种猕猴桃聚为一支，其中软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃与Genbank上下载的大籽猕猴桃序列聚为一支。通过聚类分析，可以将猫人参与其他物种猕猴桃进行区分鉴定。

图1 猫人参及其近缘种的系统聚类树

3.6 rbcL基因序列二级结构分析

猫人参及其近缘种的rbcL序列二级结构见图2。从中可以看出，二级结构图与遗传聚类分析及系统聚类分析结果相似，作为猫人参来源的对萼猕猴桃和大籽猕猴桃具有其特有的二级结构，可明显与其他物种猕猴桃进行区分。

图2 猫人参及其近缘种的脱氧核糖核酸二级结构

4 讨论

4.1 基于rbcL序列对猫人参及其近缘种鉴定的可行性分析

植物叶绿体基因与核基因相比具有相对分子质量小、结构简单等特点，且叶绿体DNA属于细胞质遗传，进化速率较快，适用于植物亲缘学分析［14］。rbcL序列全长约1 kb，具有种内进化速率低、种间进化速率高的特点，在石斛属［15］、菊科［16］等多种药用植物中体现了较好的鉴别优势。

猫人参为猕猴桃属植物，属于严格的叶绿体基因组父系遗传，这一罕见而特殊的遗传方式极大地提高了猕猴桃属植物亲缘关系的复杂性［17］。有学者基于简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及多种叶绿体DNA条形码等分子生物学手段对猕猴桃属的亲缘关系及遗传多样性进行了研究［17-18］，但尚缺乏对猫人参的物种鉴定研究。本研究发现，猫人参基源物种对萼猕猴桃和大籽猕猴桃具有独特的碱基变异位点，且聚类分析对萼猕猴桃和大籽猕猴桃聚为一支，其DNA二级结构也与其他物种明显不同。因此，rbcL序列在猫人参的物种鉴定中具有较好的应用效果。

4.2 基于rbcL序列对猕猴桃属植物进行分子鉴定的可行性分析

本研究发现，rbcL序列可用于猫人参的物种鉴定研究，然而对猕猴桃属部分物种的鉴定能力较差。本研究中，中华猕猴桃、毛花猕猴桃、浙江猕猴桃、长叶猕猴桃的基因序列一致，软枣猕猴桃和黑蕊猕猴桃的基因序列一致，将毛花猕猴桃在Genbank上进行检索比对，比对分值为100%的有浙江猕猴桃、中华猕猴桃、黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃等多个物种，说明基于rbcL序列在Genbank数据库中比对，尚不能对猕猴桃属植物进行完全鉴定。这可能与本文所选取的片段为rbcL部分片段有关，片段长度越短，所包含的碱基变异位点相应越少，然而片段长度越长，PCR扩增率及测序成功率相应降低。因此，对于猕猴桃属植物的鉴定，尚需要对叶绿体基因长片段或多片段联合序列对猕猴桃属植物的鉴定能力开展进一步研究。

4.3 猫人参药材DNA条形码鉴定的意义

猫人参在浙江、江西、福建等地被广泛应用，临床抗肿瘤效果明显，尤其对于胃癌及肺癌细胞抑制作用明显，然而其药用部位为地下根，在栽培基地尚未普及的情况下，目前猫人参野生资源已近匮乏。另一方面，猫人参具有两个药用来源，其一为对萼猕猴桃（俗称“白货”），其二为大籽猕猴桃（俗称“红货”），白货和红货主要根据地下根的颜色区分。猕猴桃属其他植物地下部分与猫人参药材较难区分，而其药理作用却具有较大差异。近年来市场上出现了较多猫人参混淆品，其中以黑蕊猕猴桃和中华猕猴桃居多。对猫人参进行准确的物种鉴定是保证临床用药安全的前提。

DNA条 形 码 在 鼠 尾 草 属［19］、黄 芪［20］、甘 草［21］等多种中药材的物种鉴定中发挥了巨大优势，其操作简便、经验依赖性小、结果准确可靠。本研究发现叶绿体rbcL序列可用于猫人参的物种鉴定，因此基于DNA条形码对猫人参进行鉴别具有较大的临床意义。另一方面，基于DNA条形码可探讨物种之间的系统发育及亲缘关系，可为拓宽药材资源提供一定的参考。