基于UHPLC-Q-Exactive细胞代谢组学技术探讨丹贝益肺方对人胚肺成纤维细胞的作用机制

蔡萧君，李 宇，王 钦，吴圆圆，胡 杨，颉彦鹏

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

肺纤维化是一种严重的纤维化间质性肺疾病。尽管疾病发展模式不尽相同，但症状出现后生存期一般为3～5年［1-3］。患者多数表现出非特定的症状和体征，如劳累时呼吸困难、吸气性爆裂音和无痰干咳等［4-5］。60岁以上有吸烟史的男性，患肺纤维化的风险显著增加，但确切机制仍不清楚［6-7］。目前认为，异常的肺泡上皮伤口愈合和促纤维化通路激活是肺纤维化的主导诱因［8］。此外，肌成纤维细胞的积聚和细胞外基质的产生导致肺组织瘢痕化，致使肺功能丧失［9-12］。临床诊断方法多以支气管镜和肺活检等侵入性方法为主，给患者及家庭带来极大的痛苦和负担，因此亟待发现靶向性的肺纤维化临床生物标志物。

临床上，肺纤维化细胞样本容易获得，且针对性强，这为肺纤维化的临床研究提供了合适的研究对象。随着组学技术及质谱技术的飞速发展，采用超高效液相色谱和高分辨率质谱联用（UHPLC-MS）的非靶向代谢谱分析为发现病理调控分子提供了可能。这些分子为发现新的诊断或预后生物标志物提供了机会。

丹贝益肺方由黑龙江省中医药科学院江柏华教授依据多年的临床实践经验总结而成，临床疗效显著［13-17］。本研究在前期实验结果的基础上采用代谢组学技术研究人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的代谢情况，并以丹贝益肺方加以干预，从代谢通路及关键代谢酶角度揭示丹贝益肺方治疗肺纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

MRC-5购自北京协和细胞资源中心。人胚肺正常细胞购自凯基生物有限公司中心。2-甲氧基乙氧基甲基氯/厄尔平衡盐溶液（MEM/EBSS）培养基购自北京协和细胞资源中心。四甲基噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司，批号20200615）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京索宝来有限公司，批号P1022）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素-链霉素混合溶液（美国HyClone公司，批号SV30009）；超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨（UHPLC-Q-Exactive）质谱系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）；酶标液M15（上海纤检仪器有限公司）；XPR205D5/AC分析天平（梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；ZJHK-40L超纯水机（天津卓精虹科仪器设备技术有限公司）。

丹参、平贝母、桃仁、地龙、川芎、桔梗、黄芪、党参、补骨脂、麦冬、五味子均购自哈尔滨世一堂有限公司，经黑龙江省中医药科学院主任药师杜虹韦鉴定为正品。

1.2 丹贝益肺方提取物及PBS、MTT溶液制备

丹贝益肺方的组成：丹参、黄芪各30 g，平贝母、党参、麦冬、桔梗各20 g，川芎、桃仁、五味子、补骨脂、地龙各15 g。以上药物按照传统工艺［17］，由黑龙江省中医药科学院药剂科监制，蒸馏水稀释成1 mg/mL的丹贝益肺方提取物。

将PBS缓慢加入三蒸水，完全溶解后装入100 mL玻璃小瓶中，用塞子塞紧后用纱布包严，用棉线扎紧，高压蒸汽灭菌后4℃保存，即为PBS溶液。

称取0.085 g的MTT粉末加入17 mL的PBS溶液中，以0.22 μm一次性过滤器过滤除菌，置-20℃保存，即为MTT溶液。

1.3 实验分组与处理

将经丹贝益肺方提取物预处理24 h的MRC-5设为给药组，弃去预处理液，加入细胞维持液，在37℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养72 h后收获上清液；另取未经丹贝益肺方提取物干预的MRC-5为模型组，未经丹贝益肺方提取物干预的人胚肺正常细胞为空白组，两组其他处理与给药组一致。收集三组上清液标本后置-80℃保存，用于代谢组学分析。

1.4 样本处理

取各组样本，0℃水浴解冻100 μL，按1∶4比例加入纯甲醇400 μL，涡旋震荡10 min，静置60 min，14 000 r/min离心15 min，离心半径为16 cm。取上清液用于代谢组学检测。

1.5 各组细胞代谢组学测定

采用UHPLC-Q-Exactive质谱系统，色谱柱为Accucore RP-MS Column（100×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水、B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱条件：0～4 min，99%A；4～5 min，99%A→25%A；5～6 min，25%A→15%A；6～9 min，15%A→1%A；9～10 min，1%A→99%A。

质谱采集模式首先分别以正负离子模式下的全扫模式对所有样本进行采集，扫描范围50～1200 m/z，其中，正离子电压喷雾电压3500 V、负离子电压喷雾电压2500 V、鞘气流量40 Arb、辅助气流量6 Arb、反吹气流量0 Arb、离子传输管温度350℃。批量扫描后，将各组样本各自混合，再运用Acequire X模式的数据依赖性扫描进行一级、二级数据的精准定性采集。

1.6 MTT法检测细胞增殖抑制率

活细胞线粒体内膜呼吸链中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的深紫色甲臜结晶状颗粒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。甲颗粒能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，在一定细胞数量范围内，MTT结晶量与细胞数成正比，在570 nm波长处测定，可反映活细胞的数量。给药组给予50 μg/mL的丹贝益肺方提取物，再向各组加入含有10%FBS的MEM/EBSS培养液，置于37℃、5%的CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养72 h。在避光条件下加入20 μL的MTT（5 mg/mL），置于37℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4 h后，取上清液加入150 μL的DMSO溶液，摇匀置于酶标仪，490 nm读取吸光度（OD）值。设置无细胞只加空白培养基为调零组，每组设6个平行孔。利用OD值计算细胞增殖抑制率，设OD值为A，细胞增殖抑制率=（给药组A-调零组A）/（模型组A-调零组A）×100%。

1.7 数据分析

采用Compound Discoverer 3.1数据处理系统对采集的全扫数据及包含一级、二级碎片信息的Acequire X定性数据，进行数据预处理及模式识别分析。通过无监督的主成分分析方法（PCA）对所有样本进行多维数据的组间评价。PCA能客观反映各组样本的组间差异和总体趋势，对模型评价及药物干预作用有客观及全面的指导意义。进一步通过t检验及偏最小二乘判别分析（PLS-DA）筛选空白组和模型组间的差异离子信息，结合火山图信息，通过Fold Change及P值的大小确定差异离子，并通过mzCloud及mzVault构建的标准品数据库进行鉴定。最后通过Metaboanalyst 4.0在线工具对差异离子进行富集分析，聚焦肺纤维化的发病机制及丹贝益肺方可能的干预机制。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制情况比较

与空白组比较，模型组细胞OD值降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，给药组细胞OD值升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。给药组细胞增殖抑制率为94%，明显高于模型组。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制情况比较（n=6）

2.2 代谢组学结果

整体代谢轮廓如图1所示（以正离子模式数据为例）。空白组、模型组和给药组聚类明显，给药组与空白组呈部分重合状态，证明丹贝益肺方对MRC-5有显著的干预作用。模型组整体与空白组及给药组差距较大，证明MRC-5与人胚肺正常细胞的代谢有明显差异。

图1 各组样本主成分分析得分图

进一步采用PLS-DA对空白组和模型组间进行对比筛选，选择Fold Change大于1且P＜0.05的成分作为差异离子，并以可视化形式将两种数据以火山图横纵坐标形式进行整合，见图2。结合PLS-DA火山图，选择远离原点的数据作为判定依据进行筛选，见图3。

图2 空白组和模型组的火山图

图3 空白组和模型组偏最小二乘判别分析图

生物标志物鉴定是代谢组学的难点和重点，为达到对差异成分的精准鉴定，本部分采用一级母离子数据和二级碎片信息数据相结合的方法对代谢物质谱信息进行解析，同时比对标准品数据库信息进行鉴定，最终得到6个差异代谢物，分别为溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、左旋肉碱、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺。见表2和图4。鉴定过程以PE、左旋肉碱、谷氨酰胺及谷氨酸为例。见图5。

图4 人胚肺成纤维细胞生物标志物含量箱型图

图5 差异代谢物二级鉴定过程

表2 人胚肺成纤维细胞生物标志物详表

为明确MRC-5代谢异常的通路及代谢过程，将上述结果带入在线数据处理系统进行通路富集分析，结果见图6。主要涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺代谢等。将相关代谢物及代谢通路汇总绘制肺纤维化细胞代谢通路示意图，见图7。

图6 人胚肺成纤维细胞代谢通路富集分析

图7 人胚肺成纤维细胞代谢通路图

3 讨论

近年来，受环境变化的影响，肺纤维化患者逐年增加，但临床上有效且不良反应小的药物尚未被发现。丹贝益肺方是黑龙江省中医药科学院江柏华教授依据多年临床经验总结而成，疗效显著，但其存在组方复杂、成分颇多、作用靶标不明确等问题，严重制约了本方的推广。

目前，随着仪器和分析技术的飞速发展，组学技术正逐渐成为解决生命科学问题的主力手段，其中代谢组学是在基因组、蛋白组、转录组之后新兴的组学技术。不同于以往常规的检测方法，代谢组学采取高通量的检测手段对生物体宏观代谢进行综合考察。因此，本课题基于细胞代谢组学，采用UHPLCQ-Exactive质谱技术对丹贝益肺方作用靶标进行研究，为丹贝益肺方治疗肺纤维化提供可靠数据支撑，以期发现新的生物标志物用于临床诊断和处方指导。

本研究共得到6个差异代谢物，分别为LPC、PEs、左旋肉碱、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。LPC可调节许多直接参与肺纤维化的基因表达，如一氧化氮合酶、生长因子（如表皮生长因子、血小板衍生生长因子和黏附分子），还可调节细胞增殖和迁移［16］。Mizobuchi等［18］发现磷脂酶A2可将磷脂酰胆碱转化为LPC，参与溶血磷脂酸生成，抑制自交轴蛋白表达，降低肺纤维化患病概率。本研究发现，给与丹贝益肺方提取物干预后，LPC水平表现出回调趋势，表明LPC可能对肺纤维化有抑制作用。

PE是生物膜中含量第二丰富的磷脂，与LPC一起构成了大多数真核细胞膜的骨架。PE对细胞分裂至关重要，但PE缺乏时，细胞线粒体因形态异常无法完成细胞分裂和分离。有研究表明，细胞中PE的增加会提高氧化能力，而脂质氧化的增加是神经系统疾病的一个共同特征［19-20］。此外，有研究认为PE水平的升高可以作为肺癌的诊断标志［21］。本研究中，给与丹贝益肺方提取物干预后，PE表现出上调趋势，表明PE升高可能对肺纤维化有抑制作用。

有研究表明，肺组织中的游离肉碱水平可能与进行性肺气肿有关，而三羧酸（TCA）循环的上调导致腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成增加，气道腔中细胞外ATP水平的增加通过炎症细胞的募集和激活，加速炎症和组织降解，与肺纤维化发病机制相关［22］。本研究中，模型组细胞中左旋肉碱含量呈升高趋势，给药组左旋肉碱含量下调，表明丹贝益肺方提取物干预可以有效抑制肺纤维化。

谷氨酰胺是细胞增殖和生长的代谢产物之一，经谷氨酰胺酶脱氨基生成谷氨酸，谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸进入TCA循环为细胞氧化供能。研究表明，转换生长因子-β1（TGF-β1）可增强谷氨酰胺酶1的表达，从而增强肌成纤维细胞中的谷氨酰胺分解；阻断谷氨酰胺分解或沉默谷氨酰胺酶1，可减少TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化［23］。本研究发现，经丹贝益肺方提取物干预后，谷氨酰胺呈下调趋势，且基本达到正常水平，提示其可能参与抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程。

既往肺纤维化生物标志物研究中未发现天冬氨酸、谷氨酸，本研究发现经丹贝益肺方干预后二者均呈上调趋势，但其明确的分子机制还需进一步深入探究。目前已有研究报道，抗氧化多肽的抗纤维化活性与残基天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺密切相关［24］，表明天冬氨酸与肺纤维化存在相关性。

本研究旨在直观分析MRC-5的代谢表达谱，为确定肺纤维化诊断和治疗的代谢标志物提供可靠依据。结果表明，肺纤维化的形成机制较为复杂，涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代谢及D-谷氨酰胺代谢等通路。这些代谢物的变化与肺纤维化及其他肺部疾病密切相关，可作为预测肺纤维化发展的群体标志物，代谢调节可能是肺纤维化新疗法发展的一个目标。