基于Catwalk步态分析系统评价三化汤对大脑中动脉闭塞大鼠的影响

王天华，刘丽珠，燕富琳，栾 皓，李永谦，张玉坤，李 燕，赵海军

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.齐鲁工业大学，山东 济南 250353）

中风具有发病急、病死率高的特征，且由于长期缺乏有效的治疗措施，已成为人类健康的最大威胁之一［1］。世界卫生组织流行病学调查结果显示，我国中风发病率位居世界首位，70%～85%的患者遭受长期残疾的痛苦［2］。因此，提高患者的运动能力及生活质量是中风研究领域的主要目标之一。

Catwalk步态分析系统被认为是评估动物运动和步态损伤最灵敏的工具之一［3］，最初用来评估大鼠在脊髓损伤前后的活动情况［4］。近年来，该系统在中风动物模型功能缺损评估中的应用逐渐增多［5-7］。既往研究显示，Catwalk系统对缺血性中风后的运动能力改变表现出高度敏感性［8］。

中医认为气机失调为中风发生的始动因素，玄府闭塞、腑气不通是中风发生的重要机制之一。腑气不通可阻滞机体气机，导致患者脏腑阴阳失调，诱发中风。中医经典名方三化汤出自刘完素《素问病机气宜保命集》，为通腑法治疗中风的代表方剂，经过长时间的临床实践，疗效可靠［9］。本研究结合Zea Longa评分与Catwalk步态分析系统分析运动参数，综合评价三化汤对于改善大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠运动功能缺损的作用，为研究通腑法治疗中风、改善中风后运动功能提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级成年雄性Wistar大鼠36只，体质量（250±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SCXK（京）2016-0006，动物饲养于国家中医药管理局微循环三级实验室。获得山东中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号SDUTCM 20190311012）。饲养条件为12 h/12 h-明/暗循环，温度23～25℃，相对湿度45%～50%，自由进食颗粒食物和水。

1.2 实验药物

三化汤药物组成及用量参照刘完素［10］《素问病机气宜保命集》，大黄、枳实、厚朴、羌活四味药各等分，购于山东新中鲁中医院，经山东中医药大学李峰教授鉴定，分别为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatumL.）的干燥根和根茎，芸香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）的干燥幼果，木兰科植物厚朴（Magnolia officinalisRehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，伞形科植物羌活（Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang）的干燥根茎和根，均符合《中国药典》2020年版标准。药物处理按浸泡、煎煮、过滤等步骤操作，将两次水煎液混合浓缩至含生药0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL三种质量浓度；西药尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14022821，规格：20 mg）为阳性对照药，使用前用生理盐水溶解成质量浓度为0.72 g/L的悬浊液。三化汤水煎液保存至4℃冰箱备用，尼莫地平悬浊液现用现配。

1.3 实验仪器

1.4 模型制备

参照Zea Longa的方法复制MCAO模型［11］，造模前使用异氟烷诱导麻醉大鼠，后转入操作台持续麻醉。在颈部腹面正中线右侧旁开5 mm行纵行切口，皮下组织深部钝性解剖后，使用玻璃分针分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用6.0丝线结扎右侧颈总动脉近心端和颈外动脉近分叉部，于颈总动脉分叉处近端约5 mm处行动脉切开术，经颈总动脉切口将MCAO栓线植入颈内动脉约20 mm，通过加热毯控制动物核心体温始终保持在37℃，切口逐层缝合；大鼠麻醉清醒后，采用Zea Longa神经功能缺损评分法［12］，将评分2～3分的大鼠随机分为模型组、尼莫地平组、三化汤低剂量组、三化汤中剂量组、三化汤高剂量组5组，每组6只。假手术组大鼠接受同样的手术，只是将栓线向前推进到颈内动脉约5 mm处。

1.5 给药方法

三化汤低、中、高剂量组分别灌胃0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL质量浓度的药液；尼莫地平组灌胃药物为尼莫地平悬浊液0.72 g/L；假手术组与模型组灌胃等体积生理盐水；每日灌胃1次，共7 d；其他操作均保持一致。

1.6 观察指标

1.6.1 Zea Longa神经功能缺损评分 分别于造模前（T1）、造模后第1天（T2）、造模后第3天（T3）、造模后第5天（T4）、造模后第7天（T5），对各组大鼠进行Zea Longa神经功能缺损评分，评分标准见表1。

表1 Zea Longa神经功能缺损评分标准

1.6.2 Catwalk步态数据采集 利用Catwalk步态分析系统，从平均运动速度、持续时间、站立时间、摆动时间、摆动速度、站立行走模式、步幅、爪间宽度8个方面评价大鼠运动功能恢复情况，利用Auto-analysis技术，进行数据自动读取分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，两组间采用LSD检验方法进行两两比较，取α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Zea Longa神经功能缺损评分

T1时点，各组Zea Longa神经功能缺损评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；T2时点，5个造模组的Zea Longa神经功能缺损评分均显著升高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；T5时点，三化汤高剂量组Zea Longa神经功能缺损评分低于模型组（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠造模前后Zea Longa神经功能缺损评分比较±s，分）

表2 各组大鼠造模前后Zea Longa神经功能缺损评分比较±s，分）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

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2.2 Catwalk步态分析

2.2.1 整体运动水平

2.2.1.1 站立时间 与假手术组比较，模型组四肢站立时间均明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，三化汤低、中、高剂量组四肢站立时间均明显缩短（P＜0.01），尼莫地平组四肢站立时间亦缩短（P＜0.05）。与尼莫地平组比较，三化汤低、中、高剂量组右侧前后肢（除低剂量组右后肢外）站立时间均缩短（P＜0.05）。见表3。

——司法鉴定管理通过动态的事后监管满足监管机制的创新要求。《实施意见》针对司法鉴定监管存在的问题通过监管机制创新来解决：一方面跳出了传统的审核登记管理的静态模式，实行了动态的监管模式，强调事中事后的监督，为司法鉴定监管带来了新的课题。另一方面，司法鉴定监管不仅仅在处罚，还在于激励。其中，激励机制的建立不仅会给司法鉴定管理制度带来监管方法的创新，也体现了司法鉴定管理的新理念，对于促进司法鉴定行业的有序发展具有重要意义。

表3 各组大鼠单脚站立时间比较（±s，s）

表3 各组大鼠单脚站立时间比较（±s，s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与尼莫地平组比较，△P＜0.05。

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2.2.1.2 平均运动速度及持续时间 与假手术组比较，模型组与尼莫地平组平均运动速度均下降（P＜0.01）、运动持续时间均明显延长（P＜0.01）；与模型组比较，三化汤低、中、高剂量组平均运动速度均增加（P＜0.05）。与尼莫地平组比较，三化汤低、中、高剂量组运动速度均增加（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠平均运动速度及运动持续时间比较（±s）

表4 各组大鼠平均运动速度及运动持续时间比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与尼莫地平组比较，△P＜0.05。

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2.2.1.3 摆动时间 与假手术组比较，模型组四肢摆动时间均增加（P＜0.05）；与模型组比较，三化汤低剂量组四肢摆动时间均下降（P＜0.05），三化汤中剂量组左前肢、左后肢、右后肢摆动时间下降（P＜0.05），三化汤高剂量组左前肢、左后肢、右前肢摆动时间下降（P＜0.05）。与尼莫地平组比较，三化汤低剂量组左后肢、右前肢、右后肢摆动时间下降（P＜0.05），中剂量组左前肢、右后肢摆动时间下降（P＜0.05）；高剂量组左前肢、右前肢、右后肢摆动时间下降（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠四肢摆动时间比较（±s，s）

表5 各组大鼠四肢摆动时间比较（±s，s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与尼莫地平组比较，△P＜0.05。

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2.2.1.4 摆动速度 与假手术组比较，模型组四肢摆动速度均减慢（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组左前肢、右前肢、右后肢摆动速度提升（P＜0.05）；与尼莫地平组比较，三化汤低剂量组左后肢、右前肢摆动速度快于尼莫地平组（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠四肢摆动速度比较（±s，cm/s）

表6 各组大鼠四肢摆动速度比较（±s，cm/s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与尼莫地平组比较，△P＜0.05。

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2.2.1.5 站立行走模式 与假手术组比较，模型组Support_Three模式与Support_Four模式占比增高。与模型组比较，三化汤低剂量组与高剂量组Support_Four模式占比减少；三化汤高剂量组与尼莫地平组Support_Three模式占比相近，三化汤中剂量组占比30.318%，均低于模型组占比53.987%。三化汤各组Support_Diagonal模式占比均大于28%，高于尼莫地平组。三化汤中剂量组与尼莫地平组Support_Girdle、Support_Single步态模式占比相近；中剂量组与尼莫地平组均出现了Support_Zero步态模式。综上所述，用药各组大鼠步态均出现了不同程度的改善，三化汤中剂量组与尼莫地平组步态分布最接近，同时优于尼莫地平组。见表7。

表7 各组大鼠站立-行走模式比较 %

2.2.2 四肢运动水平

2.2.2.1 步幅 与假手术组比较，模型组和尼莫地平组四肢步幅均明显减少（P＜0.01）。与模型组比较，三化汤低、中、高剂量组四肢步幅均增加（P＜0.05）。见表8。

表8 各组大鼠步幅比较（±s，cm）

表8 各组大鼠步幅比较（±s，cm）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 只数 左前肢 左后肢 右前肢 右后肢假手术组 6 9.381±1.655 9.889±2.097 8.751±1.139 9.421±1.135模型组 6 3.208±1.804** 4.108±0.673** 4.917±0.882** 4.603±0.643**尼莫地平组 6 3.519±1.193** 4.001±1.473** 5.128±0.698** 5.353±0.390**三化汤低剂量组 6 6.348±0.698# 6.804±1.020# 6.573±0.464# 7.272±0.908#三化汤中剂量组 6 5.738±0.329# 6.808±1.049# 6.580±1.213# 7.353±1.589#三化汤高剂量组 6 6.433±1.268# 6.850±0.848# 6.566±0.539# 7.195±1.491#

2.2.2.2 爪间宽度 与假手术组比较，模型组和尼莫地平组前后肢爪间宽度均明显宽于假手术组（P＜0.01）。与模型组比较，尼莫地平组前肢爪间宽度窄于模型组（P＜0.01），三化汤低、中、高剂量组前后肢爪间宽度均窄于模型组（P＜0.05）。见表9。

表9 各组大鼠爪间宽度比较（±s，cm）

表9 各组大鼠爪间宽度比较（±s，cm）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 只数 前爪 后爪假手术组 6 4.133±0.161 4.476±0.528模型组 6 6.754±0.481** 7.377±0.532**尼莫地平组 6 5.389±0.291**## 6.527±0.933**三化汤低剂量组 6 5.447±0.792# 5.916±0.193#三化汤中剂量组 6 5.258±0.430## 6.078±0.914#三化汤高剂量组 6 4.940±0.710## 6.019±0.177#

3 讨论

三化汤是调畅气机、开通玄府法治疗中风的经典名方，由大黄、枳实、厚朴、羌活组成，其中大黄、枳实、厚朴三药组成小承气汤，主治阳明腑实证，主荡涤积滞、行气消痞；羌活属于祛风药，张璐在《本经逢原》中称羌活是“却乱反正之主帅”，有调顺之义，可使诸脏功能失调归于平和，唐代甄权的《药性论》记载羌活有治疗手足不遂、口眼歪斜之功效。诸药合用，共奏宣行气血、通腑开结、调畅气机、开通玄府之功。

在缺血性脑中风发作后，患者多出现心烦意躁、头昏胀痛、神志不清等肠热腑实之证，导致病情进一步加重［13］。有报道显示中风后的卧床患者发生便秘的比例为30%～60%［14］，三化汤通畅腑气、降泄阴浊、通调气血，另可急下存阴避免痰瘀之邪日久化热，从而缓解病情。

本研究显示，与假手术组比较，各MCAO模型大鼠Zea Longa神经功能缺损评分均显著升高；三化汤干预后，低、高剂量组大鼠评分均下降，证实三化汤可明显促进大鼠神经功能缺损症状恢复，随治疗时间的延长，高剂量组干预效果最好，可能与剂量效应影响有关。提示在中风急性期，三化汤可有效缓解痰热腑实症状，改善神经功能缺损情况。

整体运动协调性与站立时间、摆动时间、摆动速度密切相关。本研究显示，假手术组大鼠四肢运动功能健全、运动协调；各MCAO模型大鼠四侧肢体平均运动速度降低，运动持续时间增加、四肢步态有着不同程度的改变，此与Cao等［15］及Yang等［16］的研究结果一致。三化汤干预后，各剂量组大鼠四肢均有不同程度的步态周期缩短和摆动速度提升，证实三化汤对改善中风后步态协调性有积极作用；且三化汤低、中、高剂量组大鼠运动速度均大于模型组，提示三化汤可明显改善MCAO大鼠肢体运动功能。

步态模式作为协调性评价指标之一，对评价大鼠运动功能具有重要意义。本研究结果显示，各MCAO模型大鼠均以三只肢体着地站立支撑为主，以保持运动过程中身体的协调平衡，该结果与姚建宁等［17］的研究结果相似。MCAO大鼠通过调整步态模式代偿性维持身体平衡及运动功能，三化汤干预后各剂量组站立-行走模式均有不同程度调整，证明三化汤可以促进步态模式的调整和肢体运动功能的恢复。

肢体运动水平与步态对称性、肢体的支撑力以及重心的平衡、位移有关，可作为中风后运动康复的参考指标之一。与假手术组比较，各MCAO模型大鼠四肢步幅明显缩短，三化汤干预后大鼠的步幅增大，提示三化汤对MCAO大鼠四肢运动水平有不同程度的改善作用。与假手术组比较，造模后早期大鼠爪间宽度增加可能是代偿患肢作用，协助大鼠维持躯体平衡、协调运动等，此与张荻等［18］研究结果一致。

近年来，研究者采用了多种方法来评估中风后的运动功能障碍，如神经评分、前爪放置测试、断脚测试、脱胶测试、拐角测试和楼梯任务测试等。但这些测试大多无法避免人为干扰，实验数据不能完全体现出实验动物的完全自主性。由于Zea Longa神经功能缺损评分受到测试者主观影响较大，为了更加客观准确地评价大鼠运动功能，本实验将Zea Longa神经功能缺损评分与Catwalk步态分析相结合用以评价MCAO大鼠运动功能的改善情况。通过Catwalk步态分析系统对大鼠的不同步态进行动态和静态参数采集，准确记录四肢与爪子的运动情况，还可以检测步态协调的空间和时间，这对于四足动物研究尤其有价值。本研究显示，Zea Longa神经功能缺损评分与Catwalk步态分析结果保持一致，大鼠造模后四肢运动水平和整体运动水平均下降，出现运动功能障碍。经三化汤干预后低、中、高剂量各组大鼠运动水平呈现不同程度的改善，提示中风后早期介入三化汤治疗，对运动功能改善有积极作用。

本实验运用Catwalk步态分析系统分析了三化汤对MCAO大鼠四肢运动水平与整体运动水平的影响，证实了三化汤从肠腑论治中风的疗效，同时为将来对MCAO大鼠治疗的行为学研究及步态数据采集分析提供了参考。