线粒体相关内质网膜及胰岛素抵抗的运动干预研究进展

孙 易 ，丁树哲 *

近年研究显示，诸多细胞器不是独立运转的，不同种类的细胞器能在空间上发生物理接触（physical contact）及偶联，形成一种结构网络共同行使功能。其中，内质网（en‐doplasmic reticulum，ER）与线粒体可以在细胞的特定部位发生偶联，它们的物理连接结构被称为线粒体相关内质网膜（mitochondria associated ER membranes，MAMs）。真核细胞中，MAMs是一种相对保守的结构，在Ca2+传递、磷脂生物合成和传递、能量代谢、细胞凋亡以及细胞自噬等过程中均扮演重要角色。

有研究表明，完整的线粒体及ER正常的结构和功能对维持胰岛素信号通路不可或缺。这两种细胞器充当营养感受器和胰岛素信号通路的关键调控因子，均参与对葡萄糖代谢的调控和胰岛素抵抗发生。然而，尽管线粒体和ER在胰岛素抵抗中扮演的角色已经得到反复论证，MAMs与胰岛素抵抗和2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）关系的探索却在近几年才有所开展，日新月异的MAMs检测手段和新技术也促使MAMs相关研究蓬勃发展。此外，尽管若干证据显示运动通过MAMs改善胰岛素抵抗，然而大多仅探索MAMs的某个蛋白组分扮演的角色，未能系统性地论证运动是否通过修饰MAMs的整体结构和功能来改善胰岛素抵抗状态。为了更好地认识和解决这一问题，本研究对MAMs与胰岛素抵抗的关系进行梳理，概括、分析运动通过MAMs组分改善胰岛素抵抗的证据，总结当前的领域空白及新的研究方向。

1 线粒体-内质网结构和功能

MAMs富含多种蛋白质。基于质谱法的蛋白质组分析显示，小鼠脑组织MAMs包含1 212种蛋白质，其中19%来源于内质网，19%来源于线粒体（Poston et al.，2013）。值得注意的是，根据来源，MAMs的蛋白可以归为3类：1）MAMs驻留蛋白（MAMs resident protein），是只存在于MAMs的蛋白质；2）MAMs富集蛋白（MAMs en‐riched protein），指在细胞的其他区域也存在的蛋白质；3）MAMs关联蛋白（MAMs associated protein），指一过性地定位于MAMs的蛋白质（Poston et al.，2013）。目前，Ca2+通道三磷酸肌醇受体（inositol-1，4，5-triphosphate receptor，IP3R）、线粒体-ER系带蛋白线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、PACS-2（phosphofurin acidic cluster sorting pro‐tein 2）、伴侣蛋白Sigma 1 receptor（Sig1R）和钙连蛋白，以及参与磷脂代谢的蛋白质等诸多分子均属MAMs蛋白。

对哺乳动物来说，MAMs的重要功能之一为保障Ca2+离子的正常传递。ER和线粒体之间的Ca2+传递由IP3R、电压依赖阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）和伴侣分子葡萄糖调节蛋白质75（glucose-regulat‐ed protein 75，Grp75）共同完成。IP3R-Grp75-VDAC1复合物以及线粒体融合蛋白二聚体（mitofusins dimers，Mfns二聚体）共同充当ER和线粒体的物理连接。此外，鲜见对MAMs结构形成机制的研究，仅限了解PACS-2和Rab32负责招募其他MAMs组分。

2 Ca2+调控与MAMs介导胰岛素抵抗

胰岛素敏感指激素能诱导机体产生正常的生理反应，维持葡萄糖稳态；胰岛素抵抗则指应对正常激素水平时，机体发生低于正常的生理反应。肝脏胰岛素抵抗是T2DM的重要标志，因为胰岛素不能抑制糖异生过程，机体血糖水平升高。因此，探索MAMs与胰岛素抵抗关系及相关机制研究多以肝脏为靶定器官。从脑组织分离MAMs发现的1 212种蛋白里，293种是保守的，肝脏中也有所存在，包括钙连蛋白、Bip、Grp75和 VDAC1/2/3等（Poston et al.，2013）。

2.1 Ca2+及MAMs介导胰岛素抵抗的机制

线粒体和ER是参与Ca2+稳态调控的重要细胞器，在Ca2+依赖的信号通路中发挥作用。葡萄糖的稳态也借由Ca2+依赖的信号通路得以维持。如胰高血糖素能增加细胞内Ca2+离子浓度，导致ER释放Ca2+离子，胞浆Ca2+离子浓度上升又能诱导糖异生酶活性发生变化，或者调控糖异生相关基因的表达。线粒体对Ca2+的正常摄取无论对维持线粒体代谢还是ER稳态都十分重要。线粒体Ca2+离子浓度升高能促进丙酮酸脱氢酶磷酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶的活性，三者均是三羧酸循环（tricarboxylic ac‐id cycle，TCA循环）的重要代谢酶。由于肝脏同时富含线粒体和内质网，是胰岛素抵抗中重要的一环，因此，MAMs与胰岛素抵抗相关研究多以肝脏作为靶点器官。

ER和线粒体间的距离是Ca2+离子在细胞器间正常传递的重要决定因素。当MAMs发生变化时，ER-线粒体间的Ca2+传递发生变化，从而发生ERS、细胞凋亡和线粒体自噬等一系列事件。细胞异常代谢状态也会影响MAMs的Ca2+传递。如对细胞施加棕榈酸干预3 h和6 h后，ATP刺激导致的从ER到线粒体的Ca2+流显著减少（Shinjo et al.，2017）。

IP3R-Grp75-VDAC1复合物共同完成MAMs的Ca2+传递。IP3R是内质网Ca2+释放的重要通道。哺乳动物中，IP3R具有3种亚型：IP3R1、IP3R2和IP3R3，形成同质或异质性通道。小鼠的IP3R1在脑和胰腺β细胞中含量最丰富；IP3R2主要在心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏中表达；而IP3R3主要在胰腺、睾丸、脾脏、胸腺和胃肠道中表达。VDAC是一种大小为31 kDa的蛋白，通过与Ca2+离子和蛋白质的相互作用转运阴离子、阳离子、ATP和代谢物通过线粒体外膜。VDAC还是HK2的结合位点。研究显示，VDAC1-/-小鼠葡萄糖耐受力受损，而VDAC3-/-小鼠的葡萄糖耐受力和运动能力均正常（Anflous-Pharayra et al.，2007）。VDAC1是一个研究较多的亚型，在ATP释放、细胞氧化还原反应、自噬和细胞凋亡等过程中扮演重要角色。研究发现，肥胖小鼠肝脏裂解物中可见IP3R1/2蛋白水平增加，因此，从ER到线粒体的Ca2+流增加，线粒体ROS生成增多，代谢稳态被打破。此外，IP3R1杂合突变小鼠opt/+被高脂喂养4～6周后，出现高血糖、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗等现象，这也表明IP3R1在葡萄糖稳态维持和饮食诱导糖尿病发生中扮演着新角色（Ye et al.，2011）。也有证据显示，高脂高蔗糖喂养小鼠16周后，肝脏MAMs分离物中VDAC1和PACS-2含量显著降低，IP3R1水平无明显变化（Tubbs et al.，2014）。PDK4能通过与IP3R1-Grp75-VDAC1复合物相互作用调节细胞功能，肥胖会导致PDK4活性增加，MAMs形成增多，从而抑制胰岛素信号通路。在Pdk4-/-小鼠中可见MAMs形成减少，且不易发生饮食诱导的胰岛素抵抗（Thoudam et al.，2019）。

亲环素蛋白D（cyclophilin D，CYPD）是一种能调控渗透转换孔（permeability transition pore，PTP）开放的蛋白。Rieusset等（2016）发现，CypD与IP3R-VDAC复合物共同作用。在肝脏细胞，CypD缺失能诱导胰岛素抵抗发生，高脂喂养小鼠肝脏MAM分离物中，CypD含量显著降低（Tubbs et al.，2014）。

2.2 运动通过Ca2+调控和MAMs修饰改善胰岛素抵抗

尽管机体对运动的适应仅能在长期运动干预下获得，然而一次性运动干预常被用于探索机体对运动应激的急性反应，阐释相关分子机制。有证据表明，运动缺乏是肥胖和T2DM等胰岛素抵抗相关疾病的重要致病因素，严重危害公共健康。肝脏、骨骼肌和脂肪组织是葡萄糖利用的主要靶点，且骨骼肌是运动中葡萄糖代谢的首要位置，这是大多数运动改善胰岛素抵抗的研究均聚焦在骨骼肌的原因。已有研究探索运动对MAMs成分的影响，如强迫游泳可以通过降低骨骼肌线粒体胆固醇的含量和升高Caveolin-1蛋白水平提高ALS小鼠的生存年限，线粒体胆固醇和Caveolin-1均是MAMs的重要标记物与成分（Flis et al.，2018）；与野生型小鼠相比，REDD1敲除小鼠进行耐力运动后，AMPK激活和糖原消耗均加重（Britto et al.，2018）。涉及运动干预与胰岛素抵抗时，有研究支持运动能有效改善胰岛素抵抗和代谢紊乱，且通过修饰MAMs相关蛋白来实现。需要指出的是，当运动涉及较多的离心收缩成分时，可能会形成一过性的胰岛素抵抗，一般延续到运动后两天。

葡萄糖稳态的维持依赖Ca2+信号通路。当Ca2+稳态被破坏，葡萄糖代谢会受到影响，导致胰岛素抵抗和T2DM等病理状态的发生。研究显示，13周高脂喂养导致大鼠出现胰岛素抵抗，心肌细胞Ca2+稳态被打破，表现为Ca2+瞬流幅度和衰减率降低，心肌SERCA、NCX、RYR和LTCC等Ca2+处理蛋白的表达下调（Palee et al.，2019）。运动训练是对Ca2+稳态维持具有积极促进作用的干预方式。如6周跑台运动干预能显著改善心肌细胞Ca2+稳态和Ca2+处理蛋白的表达（Palee et al.，2019）。Liu等（2017）发现，3个月自主跑轮运动能改善小鼠脾脏淋巴细胞的Ca2+信号，表现为基础状态下细胞内Ca2+浓度增加，刺激后Ca2+瞬变（calcium transient）增加。急性抗阻运动也能显著增加骨骼肌CaMKII的磷酸化水平，表明Ca2+信号通路被激活（Kido et al.，2018）。

胰岛素抵抗不仅由糖代谢紊乱所致，脂质过载也可能通过改变糖代谢诱发胰岛素抵抗，Ca2+调控扮演着重要角色。研究显示，高脂高热量喂养小鼠骨骼肌脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）表达上调，有助于肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）增加磷脂酰乙醇胺（phosphati‐dyl ethanolamine，PE）合成，维持SR/ER Ca2+ATP酶（SER‐CA）的活性。这使得胞浆Ca2+浓度降低，抑制Ca2+依赖和AMPK依赖的信号通路，诱发胰岛素抵抗（Funai et al.，2016）。胆碱/乙醇胺磷酸转移酶1（choline/ethanolamine phosphotransferase 1，CEPT1）是磷脂合成通路的终末酶。6周高脂饮食诱导肥胖小鼠的比目鱼肌中可见CEPT1表达增加。基于细胞和骨骼肌特异性CEPT1敲除小鼠的研究显示，CEPT1缺陷导致SR中PE含量降低，PC（磷脂酰胆碱）含量增高，使得SERCA活性降低，激活Ca2+信号通路，改善胰岛素抵抗。需要指出的是，SR对Ca2+处理能力的变化使得小鼠运动耐受力减弱，即对SR的重塑是以牺牲运动能力为代价改善小鼠胰岛素抵抗状态（Funai et al.，2016）。与此类似，对代谢综合征患者进行6周二甲双胍治疗，在改善其胰岛素抵抗的同时，也会显著降低运动能力，这与AMPK通路激活有关（Paul et al.，2017）。

作为负责MAMs Ca2+传递的重要复合物，IP3R-Grp75-VDAC1的表达和作用受到运动干预的影响。3个月自主跑轮运动在改善小鼠脾脏淋巴细胞Ca2+信号的同时，也会导致IP3R2等钙调节基因的mRNA表达下调（Liu et al.，2017）。Ca2+稳态相关因子的表达下调可能是一种应对细胞内Ca2+信号增多的保护机制。骨骼肌VDAC1的表达能被急性和慢性运动干预修饰。如一次离心运动后，6 h、12 h、24 h和72 h均可见骨骼肌VDAC1的蛋白表达增加，推测此变化可能与运动干预诱导的细胞内线粒体重新分布有关（于滢等，2016）。4周跑台训练能显著增加骨骼肌VDAC1的蛋白表达（薄海等，2014）。Grp75是热休克蛋白70（HSP70）家族中的一员，在运动干预与应激保护相关研究中有所涉及。8周运动训练导致野生大鼠和STZ诱导1型糖尿病大鼠脑组织Grp75的mRNA表达显著增加，但蛋白表达水平在各组间无显著差异（Lappalain‐en et al.，2010）。

综上所述，运动对高脂饮食喂养等方式诱导的胰岛素抵抗具有积极的干预作用，可能通过对Ca2+稳态的修复实现。目前已有研究探索运动训练对IP3R、Grp75或VDAC1表达的影响，却缺乏支持/不支持运动通过MAMs处Ca2+调控相关组件改善胰岛素抵抗的直接证据，这需要进一步探索。

3 MAMs结构与胰岛素抵抗

3.1 胰岛素抵抗与MAMs关键蛋白表达

有研究显示，维持MAMs完整性对胰岛素信号通路非常重要。Tubbs等（2014）发现，与野生型小鼠相比，ob/ob小鼠和高脂喂养小鼠肝脏中的MAMs蛋白含量显著减少；且在高脂喂养小鼠饮食中添加罗格列酮能部分增加MAMs的蛋白含量。也有研究发现，代谢异常小鼠肝脏中的MAMs反而增加。Arruda等（2014）研究显示，肥胖小鼠肝脏裂解物中可见PACS-2和Sig1R蛋白水平增加。与对照组相比，ob/ob和高脂饮食喂养小鼠肝脏中，与线粒体紧密连接的ER占总ER比例显著升高，4周高脂饮食足以导致小鼠肝脏MAM连接增加。

作为促进线粒体融合的主要因子，以及MAMs的标记蛋白，Mfn2与胰岛素信号密切相关。肥胖和T2DM患者骨骼肌中可见Mfn2的mRNA表达显著降低。肝脏中，肝脏细胞Mfn2缺失会促进肝脏胰岛素抵抗发生（Sebastian et al.，2012），Mfn2过表达则能改善不当饮食导致的肝胰岛素抵抗（Gan et al.，2013）。除Mfn2外，酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）也是MAMs的标记蛋白。研究显示，上述两种分子在MAMs分离物中的表达量因棕榈酸短时干预（12 h）显著下降，表明棕榈酸干预能破坏ER和线粒体间的对话（Shinjo et al.，2017）。Mfn2被过表达时，棕榈酸干预导致的MAMs破坏和ACSL4减少得以部分恢复，Akt在Ser473位点的磷酸化程度也显著改善。上述表明，Mfn2对MAMs的结构和功能维持意义重大，代谢紊乱可能通过改变Mfn2表达干扰ER和线粒体对话，导致胰岛素抵抗发生。然而，有其他证据显示代谢紊乱小鼠肝脏Mfn2表达水平未发生显著变化，甚至增加。Arruda等（2014）研究显示，肥胖小鼠肝脏总裂解物中未见Mfn2水平明显变化，但MAM处Mfn2表达显著增加，说明肥胖可能导致Mfn2从线粒体膜向MAM处迁移。另有研究显示，高脂喂养小鼠肝脏MAMs分离物中Mfn2的含量显著增加，这可能与MAM处的适应性机制有关（Tubbs et al.，2014）。

3.2 运动通过对MAMs结构的修饰改善胰岛素抵抗

Mfns参与线粒体的生物发生和网络维持。由于线粒体是氧化代谢发生的主要场所，因此线粒体功能障碍会促进胰岛素抵抗的发生，Mfn2是其中重要的因子。研究显示，急性和慢性运动均会导致Mfn2表达增加。Mfn2的mRNA水平在10 km骑行结束24 h后显著上调；4周电刺激诱导抗阻训练能显著增加Mfn2的蛋白水平（Kitaoka et al.，2015）。

Mfn2表达异常与胰岛素抵抗相关，运动训练能通过促进Mfn2表达改善胰岛素敏感性。研究显示，13周高脂喂养导致大鼠出现胰岛素抵抗，心肌线粒体功能失调，表现为线粒体ROS水平增高，线粒体膜极化，出现线粒体肿胀，Mfn2表达降低。6周跑台训练能显著改善心肌线粒体功能失调，并上调Mfn2的蛋白表达（Palee et al.，2019）。12周运动干预导致肥胖，存在胰岛素抵抗的被试骨骼肌Mfn2蛋白水平有增加的趋势（P=0.07）（Fealy et al.，2014）。5周中等强度的跑台训练尽管对db/db小鼠心肌Mfn2蛋白水平未见显著影响，但能显著提高Mfn2/Drp1的比值（Veeranki et al.，2016）。糖尿病还会影响机体对运动的应答。12周有氧训练能显著上调肥胖被试Mfn2的表达水平，却不能影响早发T2DM患者骨骼肌Mfn2的蛋白表达水平（Hernandez-Alvarez et al.，2010）。

除了作为经典的线粒体融合蛋白介导线粒体融合过程，Mfn2还能通过被PINK1/Parkin泛素化降解促进ER从线粒体中分离，利于线粒体自噬的发生（McLelland et al.，2018）。线粒体自噬是线粒体质量控制的重要环节，自噬过多导致细胞应激和骨骼肌损失，自噬不足则促进异常蛋白质堆积（Heo et al.，2017）。PINK1/Parkin依赖的自噬是线粒体自噬的两条重要途径之一，肥胖和T2DM均导致PINK1表达降低（Ruegsegger et al.，2018）。身体活动具有改善肥胖诱导线粒体自噬受损的作用（Heo et al.，2017）。尽管线粒体自噬研究还比较稀缺，但考虑到Par‐kin在运动诱导线粒体自噬中的重要功能（Chen et al.，2018），可提出合理假设：运动干预通过上调Parkin表达降解Mfn2，促进ER-线粒体分离，利于通过线粒体自噬改善机体胰岛素抵抗。

4 MAMs介导胰岛素信号通路改变

4.1 胰岛素信号蛋白在MAMs处的表达及胰岛素抵抗

Akt/PKB是胰岛素信号通路中的关键分子，胰岛素能刺激肝脏匀浆和MAMs分离物中的Akt发生Ser473位点的磷酸化。与肝脏匀浆相比，胰岛素对Akt磷酸化的作用在MAMs分离物中表现得更明显，表明胰岛素能导致Akt被招募至MAMs，且MAMs在肝脏中参与胰岛素信号通路（Tubbs et al.，2014）。若干MAMs驻留蛋白均是Akt的底物，包括IP3R、PACS-2和己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）等（Betz et al.，2013；Khan et al.，2006）。Akt和p-AktS473在位置上均与IP3R1邻近，胰岛素刺激能增加Akt-IP3R1和p-AktS473-IP3R1的紧密联系，表明线粒体和ER间的连接对调节胰岛素信号通路很重要。Akt通过磷酸化IP3R调控Ca2+从MAMs中释放，从而控制凋亡。Akt还能通过磷酸化HK2，促进HK2和MAMs蛋白VDAC1的联系，使得HK2磷酸化葡萄糖，刺激糖酵解（Gottlob et al.，2001）。当Akt被抑制时，HK2与VDAC1分开，导致VDAC1关闭，线粒体膜电位增加。

作为Akt的上游分子，mTORC2在MAMs处诱导Akt在Ser473位点发生磷酸化，控制生长因子介导的MAMs完整性、Ca2+流和线粒体生理功能（Betz et al.，2013）。然而，位于MAMs的mTORC2对疾病的作用机制尚不明确。研究认为，定位于MAMs的REDD1能破坏MAMs完整性，并在低氧和饥饿等条件下通过抑制MAMs的Akt/HK2和PRAS40/mTORC1信号通路降低氧耗与ATP生成（Brit‐to et al.，2018）。尽管目前尚无探索REDD1对胰岛素抵抗作用的研究，但已有研究认为，REDD1可能与癌症、糖尿病和帕金森氏症等代谢疾病相关。

4.2 运动通过调控MAMs胰岛素信号相关分子改善胰岛素抵抗

作为胰岛素信号通路的重要分子，Akt被认为在胰岛素刺激葡萄糖转运中起到关键作用。Akt有3种亚型：Akt1、Akt2和Akt3，其中Akt2缺陷小鼠表现出肝葡萄糖生成异常等症状。从已有研究来看，运动对Akt功能的影响不甚一致。多数证据支持运动通过Akt通路改善胰岛素抵抗。如8周游泳运动能显著增加高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠股四头肌的Akt和AktSer473含量（Qi et al.，2016）；6周抗阻训练显著上调糖尿病大鼠骨骼肌p-Akt和GSK-3β的表达（Kido et al.，2018）。也有利用分离肌肉方式的研究显示，肌肉收缩不能刺激大鼠外斜肌或腓肠肌中的Akt活性增加（Brozinick et al.，1998）。除了调控磷酸化水平外，运动训练还能通过抑制iNOS表达及Akt的S-亚硝基化修饰改善胰岛素抵抗（Tsuzuki et al.，2015）。TRB3是一种能通过与转录因子和蛋白激酶发生作用参与细胞生长、分化和代谢的蛋白质。高脂膳食、肥胖和T2DM均能诱发TRB3表达上调。研究显示，单次运动即能降低ob/ob小鼠的TRB3表达，打破TRB3-Akt的关联，使得Akt的磷酸化水平和活性均显著增加，糖异生相关酶PEPCK的表达下调。表明，运动能通过抑制TRB3的表达激活Akt，改善胰岛素抵抗（Marinho et al.，2015）。

作为Akt的上游分子，mTORC2参与调节胰岛素诱导的葡萄糖摄取。Kleinert等（2017）研究显示，尽管Rictor（mTORC2的重要组分）敲除小鼠骨骼肌葡萄糖摄取在安静状态下没有异常，但在跑台运动中却明显受损。这表明，mTORC2是运动调控骨骼肌葡萄糖摄取信号通路的重要环节。有证据支持，运动干预通过调节mTORC2表达改善胰岛素抵抗，如高脂喂养15周可致大鼠比目鱼肌mTORC2表达下调，出现胰岛素抵抗；8周有氧运动结合正常饮食则能改善 mTORC2表达（Bae et al.，2016）。mTORC细胞内转位有助于其功能发挥，如受到进食和抗阻运动刺激后，mTORC1倾向于转位至细胞边缘，mTORC2则不会移位，始终位于细胞膜处（Hodson et al.，2017）。尽管运动干预对Akt和mTORC2的表达以及对胰岛素抵抗的改善作用明确，但MAMs处的Akt和mTORC2是否参与上述过程，运动应激是否通过刺激Akt/mTORC2朝向/远离MAMs转位改善胰岛素抵抗，亟待进一步解决。

5 当前存在的问题以及未来研究方向

尽管MAMs与胰岛素抵抗的相关研究持续开展，但尚存以下问题和研究盲区暂未解决：1）已有基础研究多以肝脏作为研究对象，缺乏源于其他关键器官/组织的证据支持。2）尽管已有运动通过MAMs相关分子改善胰岛素抵抗的研究，如Akt和Mfn2等，但这些研究只是对该类分子的整体表达水平进行测定，没有靶定性地探索这些分子在MAMs处发挥的作用。以Mfn2为例，尽管肥胖小鼠肝脏总裂解物中未见Mfn2含量发生变化，但MAMs处的Mfn2表达却显著增加。因此，如能在未来研究中有针对性地检测不同细胞器及细胞结构中MAMs关联分子的表达，有助于更深入地理解运动干预胰岛素抵抗的分子机制。3）现有的胰岛素抵抗与MAMs结构的研究间尚呈现相互矛盾的结果。4）MAMs线粒体和内质网间的距离变化是否是运动改善胰岛素抵抗的作用机制之一尚需探索。线粒体和内质网之间维持合适的距离是保障Ca2+传递与脂质传递有序发生的重要前提，然而，运动改善胰岛素抵抗是否部分通过操控两种细胞器间的距离来实现，有待进一步研究。