生物矿化胶原在骨缺损治疗中的研究及应用现状

孙守野 李少荣 崔宇韬 许航 王靖玮 陈冲 王雁冰 彭传刚

0 引言

天然骨组织是一个具有多层次结构的复杂生物矿化系统，其基本单位是矿化胶原(mineralized collagen，MC)，是由有序的胶原和羟基磷灰石(hydroxylapatite，HA)组成[1-2]。自然界中，胶原蛋白的种类十分丰富，在脊椎动物中有20多种，其中，人体内主要是Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen，ColⅠ)。胶原蛋白在细胞内合成后，被分泌出细胞外，再经历矿化过程，以特定结构分布在骨基质中[3-4]。MC是各种结缔组织如骨、软骨、肌腱等的组成部分，在人体中发挥重要作用[5]。

细胞外骨基质含有60%～70%的矿物成分，20%～30%的胶原纤维，10%～20%的水，其中矿物成分主要是纳米级羟基磷灰石晶体[6]。骨基质包括有机质和无机质。骨基质的有机成分主要为骨胶原，骨胶原中 90%为ColⅠ[1]。ColⅠ不仅是骨骼弹性和韧性的主要构筑者，也是骨盐赖以栖息的场所，其代谢状况可以直接反映整体骨代谢的概貌。无机质主要为以钙盐为主的矿物，对胶原起矿化作用。体外合成MC正是模仿骨基质的结构，这相比其他材料可以更好地促进成骨过程，并且不会产生局部反应[7]。

临床上骨缺损的发生率正在增加，形成骨缺损的原因有很多，如严重创伤、肿瘤、全身性疾病等[8-9]。目前，骨缺损的治疗方法主要包括局部处理联合自体或者异体骨移植。这两种方法各有利弊，自体骨移植受到移植骨的大小的限制，同时还会在供区留下创伤；异体骨移植则会产生一些免疫排斥反应或者局部血管炎症反应[10]。骨组织工程是一种生物技术和材料工程相结合的新型骨缺损治疗途径，具有副作用小，治疗效果较好的优点，在临床治疗方面具有巨大的潜力。MC有良好的生物相容性，作为移植物不仅有一定的力学强度并且安全性较高，所以直接应用MC或者MC联合药物、3D打印支架等不同策略，在骨缺损治疗领域是一种有巨大潜力的方案[11-13]。

本文从MC的概念、机制、结构、应用等方面进行介绍，其中重点强调了MC在骨缺损修复中的研究和应用现状。

1 生物矿化胶原的矿化机制

胶原的矿化，是指在天然骨组织中HA结晶以片状形式结合于胶原纤维间隙中。这是促进骨组织生长的重要因素之一。MC不是简单地将HA加入胶原中，这样产生的胶原仅表面掺有HA，真正的内部间隙中却含量很少[14]。真正的MC是把HA结晶结合在胶原纤维内部，这不仅可以增强胶原纤维的机械强度，有利于承担骨组织负重，充分的矿物还可以起到促进骨组织分化和骨生长的作用[15-16]。

胶原纤维在骨生长过程中起促进HA成核和晶体生长的作用[17]。在胶原纤维与HA结合部位的羧基与钙离子具有协调作用。此外，羰基也是ColⅠ生物矿化的成核位点。在溶液中，羧基和羰基中的氧原子可以与Ca2+配对，成为非均相成核的核心，然后晶体成核形成无机矿物[18-19]。关于胶原的矿化机制，目前主要有两种观点。一种观点认为MC是在骨形成过程中产生的，由聚合物诱导的液体前体形成，此过程称为聚合物诱导的液体前体过程(polymer-induced liquid-precursor，PILP)。在此过程中，无定形液体相的形成预示着HA的产生。此过程中产生的HA通过毛细血管作用卷入胶原原纤维的纳米间隙和沟槽中，促进MC的产生。无定形液态前体随后固化并且在水分子丢失后结晶为更稳定的热力学相，这表示纳米级别HA结晶成功嵌入胶原原纤维内部。

另一种观点认为胶原的矿化是通过自组装方法完成的。所谓自组装是指HA晶体有序地结合在胶原纤维的成核位点上。胶原纤维上存在羧基与羰基集团，是HA矿化的结合位点，具体是指钙离子的结合部位。当HA中钙离子与胶原结合后，胶原纤维进一步组装成具有三维网状结构的基质，成为了进一步矿化的模版[20]。矿化过程中蛋白的构象改变，使胶原纤维不溶于水，同时具有一定的力学强度。HA沿着胶原纤维长轴进行生长，逐渐在胶原内部分布均匀[21]。

与其他矿物相比，生物矿化胶原具有独特的特性。首先，它们的高度有序结构导致生物矿化胶原具有较高的强度和断裂韧性。其次，这些矿化胶原与细胞外基质相互作用。最后，在生物新陈代谢过程中沉积的矿物实际上构成了无机/有机复合材料的一部分，其有机成分在生物矿物的形成中起着骨架的作用。

2 生物矿化胶原的合成方法

Bradt等[22]报道了一种比较简单的矿化方法。他们通过使用磷酸钙盐与ColⅠ在聚天冬氨酸的促进下进行矿化，将氯化钙与磷酸二氢钠等磷酸盐与胶原和聚天冬氨酸混合，慢慢进行胶原纤维的矿化过程。当钙离子在9.0 mmol/L、磷酸离子在5.4 mmol/L的浓度时是ColⅠ进行矿化过程最适宜的离子浓度。在没有聚天冬氨酸的情况下，磷酸钙结晶在胶原纤维上的结合是不均匀的，并且不牢固。聚天冬氨酸可以使结合在胶原纤维上不稳定的磷酸钙结晶更稳定，有利于加强MC的稳定性，并且减少矿化所需要的时间。矿化成功后胶原呈均匀的乳白色，且力学强度得到较大提升[23-24]。

Maas等[25]制造了由两个半U形管和两管中间的纳米多孔膜组成的U形管装置。在合成之前将原料分成两组，分别填充到纳米孔膜的两侧，一组为含Ca2+的酸性胶原溶液，另一组为含Na2HPO4和NaOH的碱性溶液。通过将含有Ca2+的胶原蛋白压过膜，从而在胶原纤维上发生矿化过程。

Ficai等[26]以胶原凝胶和HA前驱体为原料，在37℃、pH=9的条件下进行自组装合成，采用体外矿化方法风干，制备了Col/HA复合材料。这是一种简单可行的方法来制备定向Col/HA纳米复合材料，该材料的平均聚合度为97.46%。

3 生物矿化胶原的特征与功能

当胶原纤维发生矿化时，胶原纤维内部的矿物晶体直接生长在胶原纤维上，而不是存在于某些中间分子上[14]。由于无机物含量的提高，MC在高温时水的蒸发率下降，并且矿物的含量越高，越不易失水。此外，由于矿物的加入，胶原的机械强度明显增强，矿化后的胶原具有一定的韧性，有一定的抗挤压能力和抗形变能力[27-29]。同时由于磷酸钙结晶的结合，胶原由原本的无色透明变成了浑浊的乳白色，同磷酸钙沉淀颜色一致[24]。

由于MC是从ColⅠ修饰得来，因此也具有促进骨组织生长的作用。MC可以通过促进某些与成骨相关的基因表达来达到促进骨生长的作用，比如RUNX2、OCN、SPP1以及ENPP1等与骨组织的生长相关的基因[30-31]。此外，MC还能通过调节与骨组织生长相关的酶类或者蛋白质来上调骨生长，这其中就包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等成骨因子[32]。除此之外，有研究表明，MC有调节成骨与破骨平衡的能力，通过上调成骨活动，抑制破骨活动，最终达到促进骨组织生长的作用[33]。实验结果表明胶原矿化后没有改变其原来良好的生物相容性，仍然可以作为一种安全的药物载体使用[34-35]。

研究发现，MC植入后可以提供稳定性，在促进成骨的同时自身不断降解，不仅为骨组织生长提供了空间，还避免了假体取出以及遗留等问题[36]。较好的疗效证明了MC制备的支架有潜力成为下一代合成骨移植替代品，因为其独特的性能使其比目前临床医生可用的合成替代品更接近自体组织。

4 生物矿化胶原在骨缺损治疗中的应用

理想的生物材料应该具备以下条件:(1) 材料具有多孔结构，利于血管和细胞的长入；(2) 良好的生物相容性；(3) 降解的速度与骨生长速度一致；(4) 同时具有骨诱导性和骨传导性等[37]。目前研究的骨移植材料大多是模仿自然骨结构，MC作为和天然骨组织结构和组成相似的生物材料，有足够的性能来进行体内组织工程的应用，如体内细胞的聚集、生长、分化；同时它还可以应用在细胞外基质，为组织再生做贡献。

4.1 生物矿化胶原治疗非感染性骨缺损的应用现状

随着现代社会发展，临床上骨缺损的案例愈来愈多，临床上往往通过自体或者异体植骨来解决问题，这两种方法都存在一定的弊端[38]。由于自体及异体骨移植存在的现阶段难以解决的局限性，近年来MC在骨缺损的临床治疗应用中逐渐受到关注。MC能在提供局部稳定的同时，促进骨组织生长，又因其自身的可降解性，并不会影响新生骨的长入。Qiu等[39]用MC结合冷压技术制作出了一种可用于种植的人工骨假体，符合人体正常承重，强度可以与人类骨皮质媲美，同时不会产生类似于异体骨移植的免疫反应；此外MC还能起到促进骨生长愈合的作用。MC可以明显促进局部骨组织生长，可以检测到局部与成骨相关的酶类表达增多，基因表达活性增加[35]。Chen等[40]在腰椎爆裂骨折的案例中，成功使用MC联合椎弓根螺钉进行治疗，效果十分显著，可以检测到有相关促进成骨基因的表达，局部有明显的骨整合与恢复。Gao等[41]使用钢板联合MC成功治疗一位股骨远端肿瘤刮除术后骨缺损的患者，通过钢板固定股骨远端使局部稳定，使用MC材料对骨缺损进行填充治疗，术后影像表明骨的生长良好，局部骨愈合效果达到满意效果。

MC不仅可以单独使用，还能联合某些假体或者支架使用。比如使用3D打印支架负载MC填充在缺损部位，支架可以提供足够的力学强度，胶原能够起到骨诱导和骨整合作用。Zhang等[42]使用3D打印钛支架联合纤维内MC治疗临界性股骨缺损，在缺损部位证实了有关骨生长和血管生成的基因的表达有明显增加，相关的细胞因子分泌量增多，在临界性缺损部位有较好的骨长入，表明MC具有较好的骨诱导作用。随着3D打印技术的蓬勃发展，MC与3D支架联合应用于临床治疗骨缺损有良好的前景。

Wang等[43]证实，多孔MC支架可以有效模拟体内骨基质微环境，使成骨细胞有效发育生长。Wang等[43]使用纳米HA在体外模拟骨结构，三维结构的多孔MC支架可以为细胞生长提供空间场所，有利于骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖黏附以及血管结构的长入，同时也为营养物质的输送提供了通道。通过将BMSCs种植于多孔MC支架内，形成细胞支架复合体，这使得BMSCs细胞更好地发育为骨细胞，达到局部骨缺损治疗的目的。作为一种良好的载体，MC还可以搭载血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VGEF)，从而达到促进血管长入的目的。

Huang等[36]使用MC移植物对髋臼或者股骨假体松动合并髋臼或者股骨缺损患者进行治疗，使得髋关节功能恢复并且没有产生类似于异体骨移植的副反应。研究发现，MC植入后可以提供良好的稳定性，在促进成骨的同时自身不断降解，不仅为骨组织生长提供了空间，还避免了假体取出以及遗留等问题，较好的疗效证明MC是一种具有较大潜力的移植材料。

4.2 生物矿化胶原治疗感染骨缺损的应用现状

临床上伴有细菌感染的骨缺损相当常见，严重影响骨愈合。这种骨缺损的最好治疗方法就是先控制感染，再促进骨缺损愈合[44]。作为一种良好的生物负载材料，MC可以通过联合抗菌多肽或者抗生素控制感染，同时MC还可以促进缺损部位的愈合。He等[45]使用MC联合抗菌多肽对感染性骨缺损进行治疗，结果表明MC降解后释放出抗菌多肽足以起到杀菌作用，并且可以保持长时间的缓释，可以观察到有缓慢的骨生长过程。

Lian等[44]以MC为主体负载万古霉素，验证材料的抑菌性与相容性，证实了矿化胶原不会影响抗生素的抑菌作用，同时万古霉素也不会影响MC的生物相容性和可降解性。万古霉素作为一种强力的抗生素，能够有效地在骨缺损局部发挥杀菌作用，在感染减轻后有利于骨整合的进行。Lu等[46]使用一种金属-有机骨架负载MC，再联合一种具有抗菌的药物柚皮苷对伴有感染的骨缺损进行治疗。通过金属-有机骨架与MC达到对于柚皮苷的缓慢释放作用，还能提供局部的稳定性。结果显示柚皮苷能抑制感染并且联合MC促进骨整合，能达到良好的治疗效果。

4.3 生物矿化胶原在口腔领域的应用现状

在口腔领域的治疗中，往往是使用填充物或者假体进行局部填充治疗或者自体、异体移植物治疗，近些年来组织工程学为口腔疾病提供了广阔的前景[47-49]。相比于其他部位移植物，口腔内移植物的要求较高，其中牙槽骨的填充物不仅要求有较强的愈合能力，还要求有一定的力学强度、耐磨损及稳定性。一种用特定孔隙率的MC材料应用于犬牙槽骨缺损的治疗，治疗结果较好[50]。此外还有MC联合镁钙合金复合支架的成功应用，也证实了MC的良好临床效果[51]。MC良好的成骨能力可以促进牙槽骨的愈合，也能提供局部的稳定性，在口腔领域具有一定的潜力。

4.4 生物矿化胶原治疗颅骨缺损的应用现状

近年来，颅骨缺损的发生率也不断增高。颅骨缺损在临床治疗上也可以采用MC的方法，Tiffany等[52-54]的实验结果表明新型负载锌的功能化MC支架在动物颅骨缺损模型上取得了较好的治疗效果。颅骨与面部骨骼无需太多负重，MC拥有一定的韧性，足以承受局部压力。同时，MC也是良好的载体，可以融合诸多利于颅骨修复的药物[55]。一种联合糖胺聚糖的MC的新型支架，被证实可以治疗颅骨缺损。据分析，支架通过调节BMP通路，通过上调BMP的合成来促进骨缺损愈合[55-56]。此外，Liu等[57]使用一种新型亚纤维纳米结构的MC材料成功治疗鼠下颌骨缺损，发现MC能够促进BMSCs细胞的生长、黏附和分化，可以明显促进下颌骨缺损部位的愈合。研究组发现使用MC治疗取得了良好的效果，同时MC联合治疗药物的方法相比其他方法更安全并且不受区域限制，具有一定的应用潜力。

5 总结与展望

MC自身具有促进骨组织生长的能力，可以单独作为一种促进成骨的药物使用。此外，MC还可以作为骨组织工程的药物载体，通过联合一些促进骨生长的药物，来增加成骨能力。同时，MC的体内降解过程还可以达到药物缓慢释放的效果，不会引起局部过高的药物浓度积累。ColⅠ在矿化后本身的韧性得到了极大的提升，在一些局部应力小的部位可以承担全部应力；在类似四肢这种局部应力较大的部位，MC可以联合3D打印支架使用，足以承受较大的局部应力。

虽然MC在治疗骨缺损中有许多的优势之处，但是还有一些未克服的问题，比如MC的适宜浓度等问题。不过随着骨组织工程的逐渐发展，MC在骨缺损修复愈合方面的巨大优势可以得到实现，可以丰富临床治疗的方法，成为未来临床治疗骨缺损的方案之一，造福于人类社会。