组织工程人工胆管的研究进展

袁琪 徐雯 周文策

0 引言

随着腹腔镜技术的广泛应用，临床上胆管损伤的发生率有所增加[1]。国外一项对160万例腹腔镜胆囊切除术后患者的研究调查显示，术后胆管损伤的发生率为0.5%[2]。针对胆管损伤后胆管狭窄的治疗主要依赖于手术，但术后胆管再狭窄的发生率仍然较高，这不仅影响患者的生活质量，反复胆管狭窄也会造成患者的经济负担[3]，因此，降低胆管狭窄术后再次狭窄的发生率是临床医生面临的一大挑战。目前针对胆管损伤后胆管狭窄的手术治疗方式较多，如Roux-en-Y胆管空肠吻合术、胆道内支架置入术等，但大部分手术方式或多或少都会造成十二指肠乳头括约肌功能的丧失或减弱，术后胆管炎、胆道狭窄、胆瘘和胆管癌发生的风险也会增高[4]。研究显示，组织工程人工胆管在动物胆管损伤修复中是安全、有效的，王敬等[5]也曾在临床中使用自体组织修复胆管。对组织工程人工胆管的研究目的主要是在其解决胆汁通畅引流的同时可以保留十二指肠乳头括约肌的正常功能，或者尽量减少十二指肠乳头括约肌功能的损伤，进而提升患者预后，提高患者远期的生活质量。本文通过对组织工程人工胆管的研究进展进行总结与分析，为临床医生及研究者提供参考。

1 组织工程人工胆管及其主要特征

组织工程人工胆管是利用工程学和生命科学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、替代人体胆管损伤后的生物替代物[6]。其良好的生物相容性、机械性能、生物降解性及利于组织生长的多孔结构等优势在临床应用中存在巨大潜力。

2 组织工程人工胆管发展现状

随着组织工程学技术和组织工程材料的不断发展，人工胆管的研究也出现了飞速的进步，但在临床的发展较为滞后。其发展经历了自体组织人工胆管、异体组织脱细胞人工胆管、不可吸收复合人工胆管、可吸收复合人工胆管、生物3D打印可吸收人工胆管几个阶段。

2.1 自体组织人工胆管

自体血管修复胆道用于动物实验的有猪颈静脉、鼠股动脉，但需胆道支架支撑，否则易出现狭窄。Biglari 等[7]将自体大隐静脉联合胆道支架修复胆管缺损应用于临床，术后8个月移除胆道支架，术后1年复查患者一般状况良好。Crema等[8]使用人自体带有血管蒂的空肠段修复胆道，术后未出现胆瘘等并发症，术后3年复查患者胆道胆汁引流良好。目前应用于临床的包括带蒂的圆韧带、大网膜及脐血管。在外科手术中，使用大网膜作为自体移植物来封闭、修补或加固组织已得到广泛应用，其支持和粘附局部组织的能力取决于丰富的血液供应、血管生成活性和高浓度的组织因子[9]。此外，动物实验研究表明，在组织重建中使用带蒂网膜瓣既有抗炎作用，又可促进组织生成[10]，但自体组织的大小、薄厚和取材的复杂性影响了其在临床的发展和应用[11]。自体组织人工胆管因具有良好的生物相容性、抗微生物活性、无免疫原性，且自身含多种生长因子的优势已应用于临床中，但大部分集中于对胆道缺损较小的修复。尽管有自体大隐静脉、空肠段修复胆管的临床报道，但因观察周期较短，还需进一步临床试验的验证。

2.2 异体组织脱细胞人工胆管

Struecke等[12]通过将脱细胞的同种异体动脉血管进行自体胆管细胞的再细胞化后对实验动物进行胆管修复，实验动物在研究阶段均存活，未出现严重的胆瘘或腹膜炎等并发症，且观察到植入物组织周围有新生血管生成。Chakhunashvili等[13]的研究使用脱细胞人脐动脉三维支架对兔胆管进行修复，移植物与实验动物组织融合良好。也有同种异体/异种异体脱细胞输尿管进行胆管修复的文献报道[14]。脱细胞人工胆管制备的关键在于脱细胞技术的选择，任何一种脱细胞方法都会对细胞外基质(extracellular matrix，ECM)造成损伤。脱细胞方法包括物理法、化学试剂和酶3种方式。

2.2.1 物理法

(1) 冻融：可使组织细胞胞内形成冰晶，细胞因胞液盐浓度增加而破碎，冻融对ECM的力学性能和结构影响甚微，但反复冻融后细胞内容物可继续存在[15]。(2) 压力法：在高压力负荷下，细胞膜会出现变形破裂，细胞可被机械压力有效破坏，避免了使用化学试剂导致的支架内毒物残留，机械压力对ECM的作用较小，因此是常使用的方法。(3) 机械搅拌和超声：机械搅拌贯穿于整个脱细胞过程，通常借助磁力搅拌托盘或摇振器实现，机械搅拌益于化学物质与组织充分渗入组织内部，是脱细胞常用的辅助手段。对于脱细胞过程中的超声波输出功率等相关参数仍缺乏具体报道。物理法是广泛采用的脱细胞方法，但单纯使用物理法效果欠佳，需联合使用其他方法[16]。

2.2.2 化学试剂

(1) 低渗或高渗溶液：多采用低渗高渗循环处理以彻底清除细胞，但为了ECM的高效制备需联合其他化学方法。(2) 酸和碱：可有效溶解胞质成分、清除核酸物质，但会影响ECM的结构及功能，需谨慎使用[17]。(3) 非离子去垢剂：通过破坏DNA-蛋白质、脂质-脂质、脂质-蛋白质之间的连接而起到脱细胞的作用，对蛋白质-蛋白质连接之间的作用较小，常用于制作脱细胞血管支架。(4) 离子去垢剂：可有效溶解细胞膜，将DNA从蛋白质中分离出来，但容易破坏ECM。(5) 两性离子去垢剂：需与离子去垢剂联合使用以减少对ECM的破坏。(6) 醇类：通过细胞脱水溶解达到脱细胞的目的，但易使蛋白质沉积从而破坏ECM的亚显微结构[18]。(7) 螯合剂：通过破坏细胞对ECM的粘附起到协助脱细胞的作用。

2.2.3 酶

(1) 胰蛋白酶：需与螯合剂联合使用提高脱细胞效率。(2) 核酸酶：主要用于处理脱细胞后残留的核酸，因对ECM作用的研究较少需要进一步研究。脱细胞组织可以提供具有特殊结构的支架，其保留了可以促进组织重建的生物活性物质如胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白[19-20]，但脱细胞过程中蛋白质和胶原纤维等成分的部分丢失会引起脱细胞组织力学性能的下降而导致三维结构发生变化，也会导致脱细胞组织的生物活性降低[21]，术后可能会导致感染等并发症[22-23]。异体组织脱细胞人工胆管仅用于动物实验，其在取材方面有优势，且具有良好的生物相容性，但其在临床可能带来的风险尚未可知，同时异体组织也存在伦理等诸多问题。

2.3 不可吸收复合人工胆管

不可吸收复合人工胆管主要有聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)贴片、聚丙烯网架增强胶原海绵假体等，目前仅用于动物实验。PTFE人工胆管为双层结构，在方便手术操作的同时对胆管有良好的支撑作用，且可以避免胆漏及狭窄，其内层为聚四氟乙烯材料生料管经高温烘培、拉伸、包覆及高温定型而制备，外层覆盖氟橡胶以封闭表面空隙，氟橡胶的涂抹厚度会影响人工胆管的渗透性能和力学拉伸性能。PTFE具有诸多良好的特性，如耐化学腐蚀性、低摩擦系数等，作为一种惰性材料，其热力学和化学性质非常稳定，但粘结性能和湿润性能差使其在人工胆管的制作过程中需通过表面改性的方法使其利于与氟橡胶复合。表面改性的方法包括低温等离子体改性、化学还原法及离子照射等，因不破坏材料性能，低温等离子体改性是最常用的方式,其具有易操作、加工速度快、效果良好、节能等优点[24]。PTFE人工胆管有良好的机械强度及三维立体多孔结构，但生物相容性不够理想，术后可能出现的感染和慢性异物反应等影响预后。此外，器官损伤是聚四氟乙烯移植物罕见、延迟出现的并发症，聚乙烯材料会引起纤维细胞增殖反应，导致移植物和周围组织粘连，甚至肠管穿孔[25]。尽管不可吸收复合人工胆管已经取得了一定进展，但随着可吸收材料的创新与发展，不可吸收复合人工胆管已逐渐被取代。

2.4 可吸收复合人工胆管

Miyazawa等[26]将预先植入自体骨髓细胞的由聚乙醇酸纤维强化过的聚己内酯和聚乳酸聚合物制成的人工胆管对实验动物进行胆管修复，术后6个月移植物完全溶解，切除的新胆管周围有轻微炎症，其形态与天然胆总管相似。Li等[27]使用碱性成纤维细胞生长因子结合胶原作为补片，以促胆管细胞再生的方式修复猪肝外胆管缺损，术后1月除部分实验动物出现胆汁淤积并形成少许胆泥外，大部分在术后3月行胆囊胆管造影提示胆管通畅良好，未见明显狭窄及并发症。Zong等[28]使用结合人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC)的以聚己内酯为内层、多孔的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]为外层的hMSC-PCL/PLGA双层支架修复胆管缺损，实验发现通过灌流培养的细胞支架具有较高的细胞和细胞外基质积聚，且结合人骨髓间充质干细胞的支架更利于胆道的修复。用于动物实验的有自体脂肪干细胞膜片、胶原补片、结合碱性成纤维细胞生长因子的胶原支架、由纤维素聚合甘蔗糖蜜制成的细菌纤维素膜、可吸收电纺聚羟乙基天冬酰胺-聚乳酸/聚己内酯板状支架、电纺聚氨酯人工胆管、聚癸二酸二异丙酯支架、聚二氧六环酮可吸收生物支架等。可吸收复合人工胆管可通过溶液烧铸-浸渍法、静电纺丝法、凝胶纺丝法或几种方法复合制造。烧铸-浸渍法是通过将模具浸入溶解有聚合物的溶剂中，去除溶剂后获得管状支架，虽然方法简便易行但可能会有有毒溶剂的残留，其孔径的大小和分布不易控制。静电纺丝法通过施加高压电流使电场力克服聚合物溶液表面张力而形成带电射流，溶剂在射流运动的过程中不断挥发，最终在收集器上获得纳米级的纤维，纳米纤维具有好的比表面积和孔隙率，有利于细胞的黏附、生长和繁殖[29]。凝胶纺丝法不需要电场力的作用，用注射器将在水中制成溶液的聚合物挤压出去，使溶液沉积在来回移动的转轴上，其孔径大小和分布可通过缠绕方法的不同和后处理来实现，如空气干燥和冷冻干燥等。合成聚合物在生物医学应用面临的主要问题是生物相容性的普遍缺乏，生物相容性取决于组织反应的范围和生物环境，而不是任何材料的给定属性[30]，与炎症反应和纤维包裹密切相关。胶原蛋白被大量应用于组织工程，因具有一定的机械强度和优异的生物相容性，且胶原支架有利于组织结构再生和功能重建，渗透到胶原支架中的自体细胞会分泌胶原酶降解胶原膜以便产生完整的细胞外基质从而加速其增殖和分化，最后形成天然组织。

2.5 生物3D打印可吸收人工胆管

生物3D打印技术(three-dimensional printing，3D printing)是以计算机三维模型为基础，制造人工植入支架、组织器官和医疗辅具等生物医学用品的3D打印技术。近年来在动物实验胆管修复中的应用逐渐增多。Yan等[31]将小鼠胆管细胞、硫醇化明胶与既具有纳米结构又具有生物活性的多肽两亲性分子混合物进行充分混合经退热后运用压力辅助生物打印进行3D支架打印，使用双功能的马来酰亚胺共轭聚乙二醇对支架进行二次交联增加稳定性，通过实验发现在生物墨水中加入层粘连蛋白两亲肽对胆管细胞的成熟及形成功能胆管都有很好的促进作用，使支架既具有纳米结构特征又具有生物活性。Xiang等[32]的研究将制作好的PLGA支架与甲基丙烯酸明胶(gelatin methacrylate，GelMA)/IKVAV层粘连蛋白肽/超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxid，USPIO)的支架进行交联制成PLGA/GelMA/IKVAV/USPIO复合管状支架，结果发现支架在保持良好柔韧性的同时还兼顾了支撑性和促胆管细胞生长的特性，并且具有良好的细胞密度，因具有多孔结构，其力学稳定性也得到了提升，实验将可显影材料运用在支架中便于分析术前术后支架的特征，但USPIO对细胞的毒性作用不容忽视，是否可应用于临床仍需进一步验证与研究[31-32]。Hamada等[33]使用异体猪的成纤维细胞溶液通过生物3D打印技术制作无支架的成纤维细胞管，得到了较好的效果。与传统人工胆管制造技术相比，3D打印人工胆管不需要预制模具，也不需要在锻造过程中去除大量材料和使用复杂的锻造技术，其具有更优化的结构、节约材料和能源等特点。制作生物3D打印可吸收人工胆管的关键在于对组织细胞的3D构建能力，因此打印生物材料支架结构和形貌的方式有着至关重要的作用。因成纤维细胞成活率较高，喷墨打印广泛应用于生物实体打印[34]。喷墨生物打印只能分配气泡小于10 mPa·s的生物墨水[35]，具有高度通用性的压力辅助生物打印比较适合组织工程人工胆管的制造。然而，生物墨水的制备也具有挑战性，如其在培养基中的不溶性及结构稳定性，此外还要求其具有与组织细胞相同的降解率及促细胞生长及无毒特性。生物3D打印人工胆管的发展给予了临床和相关研究者更多的期待，未来必将是疾病治疗中的一件利器。

3 展望

胆管损伤后胆管狭窄是临床胆道疾病治疗面临的一大难题。近年来随着组织工程技术的发展，其作为一种先进的技术，具有制造类似于生物结构的分层结构[36]、满足组织替换和器官移植的需求等的优势，逐渐为临床上疾病的治疗提供了新的选择[37-38]。尽管组织工程人工胆管在临床医疗方面仍然存在许多争议如支架降解后的安全性以及异物反应等问题，但随着科技的发展、技术的创新和临床的不断探索，相信未来在临床上组织工程人工胆管将会成为胆管损伤后胆道狭窄治疗的一大突破和新的治疗方式。