非小细胞肺癌铁死亡发生和治疗机制的研究进展△

刘畅，李振华，阮艳琴 ，曲来昊 ，李浩飞 ，谢超 ，李定彪

1昆明医科大学附属延安医院胸外科，昆明 650500

2云南省肿瘤免疫防治研究重点实验室，昆明 650500

3昆明医科大学公共卫生学院，昆明 650500

4新乡医学院第一临床学院，河南 新乡 453003

生命的生长、发育，甚至死亡，都是由细胞的生长和死亡所决定的。细胞凋亡和坏死是两种主要的细胞死亡形式。在过去几年中，随着细胞研究的进一步发展，越来越多的细胞死亡方式被发现，例如：自噬、细胞凋亡和坏死性凋亡。它们对细胞的生理或病理过程同样重要。2012年，Dixon等[1]在研究erastin杀死含有大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）突变的纤维肉瘤细胞的机制时，报告了一种新的细胞死亡方式，称为铁死亡。铁死亡在形态、生化、遗传和功能上明显不同于细胞坏死、凋亡和自噬。其特点是细胞内脂质活性氧显著增加，线粒体体积减小，以及膜密度升高。由于铁死亡与许多恶性肿瘤和神经退行性疾病的治疗表现出密切的联系，因此成为近年来的研究热点。本文综述非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）铁死亡发生和治疗机制，为NSCLC的治疗提供新思路。

1 铁死亡的特点

1.1 形态特征

尽管最初的研究表明，铁死亡在形态学、生化和遗传上与细胞凋亡、坏死和自噬不同[1]，但大多数研究者认为，发生铁死亡的细胞通常表现出坏死样的形态变化[2]，包括质膜完整性丧失、细胞质肿胀、细胞器肿胀和中度染色质凝聚[1，3-5]，在电子显微镜下，经历铁死亡的细胞表现出线粒体异常，例如凝结或肿胀、膜密度增加、嵴减少和外部结构断裂[1，3-4]。目前，这些细胞器在铁死亡中的作用仍然存在争议。

1.2 生化标志

铁死亡与两个主要的生物医学特征有关，即铁的积累和脂质过氧化。经典的铁死亡激活剂erastin或RAS选择性致死分子3（RAS-selective lethal 3，RSL3）通过增加细胞中铁的积累来抑制抗氧化系统[1]。脂质过氧化主要影响细胞膜中的不饱和脂肪酸。在铁死亡期间，脂质过氧化物的数量不断增加，例如最初的脂质过氧化氢（L-OOH）和随后的反应性醛。

1.3 遗传标志物

酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）是一种与脂肪酸代谢相关的酶。ACSL4的上调增加了磷脂中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的含量。因此，PUFA的含量增加，使得ACSL4成为铁死亡特有的生物标志物[6-8]。

2 调控细胞铁死亡的机制

调控细胞铁死亡的机制主要有4种，第1个与氧化应激相关，第2个与铁代谢相关，第3个与脂质代谢相关，第4个是最近发现的与铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressing protein 1，FSP1）和线粒体相关凋亡诱导因子2（apoptosis inducing factor mitochondria associated 2，AIFM2）相关的机制，且它不依赖谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）而获取脂质过氧化物。

2.1 与氧化应激有关的机制

氧化应激是一种经典途径，许多其他调节途径与其密切相关。胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（cystine/glutamate transporter，System Xc-）由细胞膜上的两个亚基组成，即溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）和溶质载体家族 3成员 2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2[9]。它是细胞内重要的抗氧化系统，可以在摄取胱氨酸的同时排出谷氨酸。胱氨酸在细胞中还原为半胱氨酸并进一步转化为谷胱甘肽（glutathione，GSH）。GSH能够减少谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）作用下的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮，并抑制GSH的合成，从而引起细胞氧化损伤甚至死亡，称为氧化应激过程[10]。GSH由谷胱甘肽-半胱氨酸连接酶合成；GPX4使用GSH作为必需的辅助因子，催化过氧化氢和细胞毒性L-OOH分别降解为水和相应的醇（L-OH），并抑制ROS的产生。根据Yang等[11]的研究，GPX4调控的铁死亡是众多独立小分子支架的共同机制。Jiang等[12]发现，肿瘤抑制因子p53可以下调SLC7A11的表达，试图通过抑制System Xc-来抑制细胞摄取胱氨酸，从而促进铁死亡。由此看出，细胞铁死亡的发生是由细胞氧化应激的调节决定的，可以诱导细胞的铁死亡。

2.2 与铁代谢有关的机制

铁是人体内不可或缺的微量元素，主要以二价铁和三价铁离子的形式存在。铁死亡的发生与铁和ROS的积累密切相关。细胞中铁的代谢包括摄取、运输和储存3个过程。小肠或红细胞降解释放的二价铁离子被铜蓝蛋白氧化为三价铁离子。之后，氧化的铁离子与转铁蛋白（transferrin，TF）结合并通过转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）进入细胞。受前列腺六段跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）的影响，三价铁离子被还原为二价铁离子，然后储存在不稳定铁池和铁蛋白中；细胞内铁蛋白由铁蛋白重链（ferritin heavy chain，FTH）和铁蛋白轻链（ferritin light chain，FTL）组成，由二价金属转运蛋白1或锌铁调节蛋白家族8/14介导。部分残留的二价铁离子在膜铁转运蛋白的影响下被氧化为三价铁离子，而这些离子会参与体内铁的回收[13-15]。此外，还有研究发现，血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）可以通过铁过载和随后的过量ROS生成来提高erastin诱导铁死亡的能力和脂质过氧化[16-18]。然而，一些研究也提出了HO-1的抗铁死亡作用，HO-1在erastin和sorafenib诱导的肝细胞肝癌中也发挥负调控作用[19]。因此，铁代谢的平衡和铁蛋白的调节可能是铁死亡的一个调节机制。

2.3 与脂质有关的机制

脂质代谢失衡与铁死亡密切相关。研究表明，长链PUFA的脂质过氧化能够诱导细胞铁死亡，铁死亡的程度与细胞中PUFA的含量有关，并且确定了它们之间的相关性[20]。PUFA首先被酰化为膜磷脂，然后被氧化，可作为铁死亡的执行信号。Kagan等[7]研究显示，在细胞中驱动铁死亡的重要磷脂是磷脂酰乙醇胺，含有花生四烯酸或肾上腺酸，即花生四烯酸的延伸产物。长链酰辅酶A合成酶-4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3参与PUFA的生物合成和重塑。而还原上述两种酶，则可以减少细胞内脂质过氧化的底物，进而抑制铁死亡的发生。

2.4 与FSP 1/AIFM 2有关的机制

有研究报道了FSP1对铁死亡的影响，揭示了一种新的有效调节铁死亡的方法[21-22]，发现FSP1可以保护细胞免受GPX4缺失引起的铁死亡。敲除FSP1基因的细胞系对铁死亡诱导剂的敏感性显著增加，而过表达FSP1基因会降低细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。此外，FSP1的表达不受p53激活的影响。FSP1的肉豆蔻酰化作用能够介导质膜上蛋白质的募集，充当质膜上的氧化还原酶，减少辅酶Q10，以及通过阻断脂质过氧化来抑制铁死亡。铁死亡诱导剂通过角鲨烯合酶-甲羟戊酸（squalene synthase-mevalonate，SQS-MVA）途径限制辅酶Q10的合成，促进脂质过氧化的积累，并导致细胞铁死亡。研究发现，FSP1可以催化还原型辅酶Ⅱ（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH）促进辅酶Q10合成，然后通过FSP1-辅酶Q10-NAD（P）H途径与GPX4平行作用以抑制铁死亡[22-23]。这一结果可以解释NAD（P）H通过FSP1对MVA途径产生影响。在此基础上，可以预测对铁死亡的敏感性。此外，相当多的肿瘤细胞系对铁死亡的抗性与FSP1的表达呈正相关，这种相关性不受细胞内GSH水平、GPX4活性、ACSL4表达或可氧化脂肪酸含量的影响。

3 铁死亡与肺癌的关系

3.1 基因位点与铁死亡的关联

Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）是肺癌中最常见的突变致癌基因之一。RAS突变发生在近30%的肺癌病例中，并显示出与预后不良的显著相关性[24-25]。当RAS突变通过合成ROS促进细胞转化和增殖时，也会引起氧化应激杀死细胞。目前尚不清楚表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变是否会导致肺癌中的ROS增多和氧化应激。而在胶质瘤细胞中，EGFR突变可以促进合成ROS，并且EGFR可以作为RAS的上游调控分子，这可能是通过激活RAS促进合成ROS实现的。大量的ROS产生将促进细胞中的铁死亡。p53基因能够通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。此外，p53基因能够通过诱导铁死亡来抑制肿瘤细胞的生长，这表明铁死亡对肿瘤细胞的生长有重要的调节作用[12]。Wang等[26]报道淋巴特异性解旋酶（lymphoid-specific helicase，LSH）通过p53信号通路调节ELAV样蛋白 1（ELAV-like protein 1，ELAVL1）的表达，而ELAVL1可以与LINC00336整合，通过稳定转录后上调LINC00336的表达，进而竞争性抑制内源性RNA和肺癌铁死亡的发生。

信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）对线粒体功能和细胞代谢具有重要的调控作用。STAT3在肺癌中被激活，它可调节细胞生长、分化、衰老和凋亡等[27]。大多数NSCLC具有持续激活的STAT3并且调节细胞增殖、细胞分化和抗肿瘤的免疫逃避。STAT3和p38的激活与NSCLC细胞增殖和转移密切相关。抑制STAT3和p38可以降低NSCLC的转移潜力[28]。有研究表明，STAT3的转录活性可以调节一些与线粒体呼吸、ROS产生和细胞死亡相关的基因，而大量的ROS会诱导细胞铁死亡[29]，这对抑制肺癌具有重要意义。

3.2 肺环境与铁死亡的关系

与其他组织相比，肺组织长期暴露于高氧环境中。在这种特殊情况下，肺癌细胞通过上调System Xc-的表达来提高细胞的抗氧化能力[30]。此外，半胱氨酸脱硫酶（cysteine desulfurase，NFS-1）在肺癌组织中高表达，已有文献证明，NFS-1可以有效缓解高氧诱导的肺癌细胞铁死亡[31]，表明肺癌细胞在高氧环境下可能对NFS-1有高选择性从而避免铁死亡。

3.3 铁代谢与肺癌的关系

铁代谢失衡与肺癌的发生发展有着密切的关系。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）在肺癌患者中表达上调，这与肺癌的发生和患者预后不良有关。通过上调铁蛋白，可以减少细胞内铁的外流，诱导细胞内铁的积累，而铁的积累又会导致铁死亡。据报道，TFR1和铁蛋白的表达分别在88%和62%的NSCLC患者中升高。在NSCLC和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）患者中都发现血清铁蛋白水平升高[32]。在NSCLC中，EGFR的激活与膜TFR1表达和铁水平均呈正相关[33]，这表明NSCLC中可能通过铁代谢途径发生铁死亡。

4 针对NSCLC铁死亡的治疗策略

4.1 小分子诱导铁死亡

铁死亡诱导剂是临床上最有可能诱导铁死亡的小分子。erastin是一种特定的铁死亡诱导化合物，能够上调肿瘤细胞中热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）依赖性热休克蛋白家族B小成员1（heat shock protein family B small member 1，HSPB1）的表达。敲除HSF1和HSPB1提高了erastin诱导铁死亡的能力，而热休克预处理和过表达的HSPB1抑制了erastin所诱导的铁死亡。抑制HSF1-HSPB1通路和HSPB1的磷酸化可以提高erastin在小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤活性。在肿瘤细胞中敲除上述基因可促进铁死亡并提高抗肿瘤活性[34]。Eaton等[35]发现，含硝基异噁唑的化合物ML210可以作为GPX4抑制剂杀死耐药肿瘤细胞，这揭示了用小分子治疗NSCLC的可能性。

另一种铁死亡诱导剂是erianin，据报道它对多种肿瘤发挥抗肿瘤作用。erianin可诱导肺癌细胞铁死亡，促进肺癌细胞G2/M期周期阻滞，抑制肺癌细胞迁移。erianin作用于肺癌细胞后，激活Ca2+/钙调蛋白（calmodulin，CaM）信号通路，从而诱导肺癌细胞铁死亡，发挥抗肿瘤作用。因此，erianin可能是一种新型的铁死亡诱导剂，是治疗NSCLC的潜在化合物[36]。

酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）是临床常见的小分子药物，可通过阻断EGFR、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等信号转导来抑制恶性肿瘤的增殖。有报道称，厄洛替尼可通过作用于EGFR增加头颈部鳞状细胞癌的氧化应激[37]，表明TKI可以通过氧化应激诱导细胞铁死亡。索拉非尼通过抑制System Xc-诱导肿瘤细胞铁死亡[38]。由此可见，TKI药物具有诱导肺癌细胞铁死亡的潜力，但需要进一步研究和验证。

4.2 潜在的基因疗法

长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）在肿瘤中的作用也引起了极大的关注，但许多具体作用仍不清楚。研究发现，lncRNA P53RRA在肺癌中是促进铁死亡的表观遗传调节因子[39]。lncRNA通过介导铁死亡参与NSCLC的发生和进展。据报道，对NSCLC进行RNA测序，发现SLC7A11可以被lncRNA的靶基因端锚聚合酶（tankyrase）抑制剂XAV939下调，并可以通过铁死亡途径抑制NSCLC的发展[40]。因此lncRNA作为铁死亡的调节剂可能成为NSCLC治疗的有效靶点。

跨 膜 蛋 白189（transmembrane protein 189，TMEM189）是一种最新识别的基因，可诱导乙烯基醚双键进入烷基醚脂质体以产生纤溶酶原，可以消除脂肪酰基辅酶A还原酶1（fatty acyl-CoA reductase 1，FAR1）-烷基醚脂质轴诱导的铁死亡。与GPX4缺乏引起的铁死亡相反，TMEM189缺失的小鼠和野生型小鼠均正常存活[41]。由于TMEM189在人类肿瘤中富集，而TMEM189的高表达导致临床获益较差，因此TMEM189被认为是比GPX4更具有前瞻性的治疗靶点[42]。

4.3 化疗联合铁死亡诱导剂

目前，靶向治疗对野生型EGFR的肺癌细胞不敏感，顺铂等铂类化疗仍然是非靶向治疗NSCLC的标准方法。铁死亡可能会增强顺铂在肿瘤细胞中的抗肿瘤作用[43]，表明可以采用铁死亡诱导剂来

增强常规抗肿瘤药物在肺癌治疗中的作用。随后的研究发现，顺铂可诱导A549和HCT116细胞中的铁死亡[44]。现有研究揭示，银杏叶提取物银杏素与顺铂协同促进NSCLC铁死亡，这可能是增强铂类化疗药物抗肿瘤功能的一种有前景的方法，有望降低NSCLC对化疗药物的耐药性[45]。在化疗耐药的肿瘤细胞中，核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）靶向基因表达下调，而细胞内神经纤维瘤蛋白2（neurofibromatosis type 2，NF2）和Hippo通路被抑制，可诱导铁死亡，此外，外周细胞GSH和NADPH水平降低，GPX4抑制剂可导致耐药肿瘤细胞死亡[46]。然而，多种药物共同治疗可能导致毒性和不良反应增加，从而可能降低患者的安全性和治疗效果。Hangauer等[47]发现，用GPX4抑制剂进行预处理或后处理，而不是联合治疗，能够耗尽在靶向治疗或化疗中存活的细胞。这种交错的治疗策略可能在临床上最大限度地提高疗效，同时可最大限度地减少与同时多药治疗相关的潜在毒性。

4.4 纳米粒子诱导铁死亡

FePt/MoS2纳米复合材料是一种新型的铁死亡药物，通过诱导Fenton反应合成ROS引起铁死亡。此外，在胞嘧啶鸟嘌呤寡脱氧核苷酸的支持下，结合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）抗体的系统检查点阻断免疫治疗，可有效消除和破坏原发肿瘤，并抑制其转移。此外，动物实验证实，上述策略具有长期免疫记忆功能，可以抑制肿瘤复发，这可以作为治疗NSCLC的新策略[48]。Zhou等[49]报道了一种可产生单线态氧（singlet oxygen，1O2）的活化体系，从而诱导亚油酸氢过氧化物（linoleic acid hydroperoxide，LAHP）与 Fe2+发生反应，诱导 ROS和1O2形成。这种系统已用于酸性环境中的特定肿瘤治疗[49]。SRF@FeⅢTA（SFT）是一种新型纳米颗粒，对抑制肿瘤进展具有重要影响，通过在SFT纳米晶体上沉积单宁酸（tannic acid，TA）和Fe3+将亚甲蓝加载到SRF中，通过光动力疗法与铁死亡有效结合从而用于治疗NSCLC[50]。

4.5 放疗

放疗被称为众多肿瘤治疗的基石，用于治疗晚期肺癌，其中患者对放疗不耐受是放疗失败的主要原因之一。电离辐射（ionizing radiation，IR）可诱导ROS和ACSL4的表达，从而导致脂质过氧化和铁死亡增加。FIN是一种铁死亡诱导剂，在灭活SLC7A11或GPX4后，可以增强抗辐射肿瘤细胞和异种移植肿瘤对IR的敏感性。动物实验表明，柳氮磺胺吡啶对Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1）突变的肺癌患者具有类似的放射增敏作用[51]，表明FIN联合IR可以提高放疗效果，这可能是治疗晚期放疗耐药NSCLC的一种可行方法。另一种增加NSCLC放射敏感性的方法是使用抗坏血酸，抗坏血酸通过铁依赖机制诱导细胞死亡[52]。

5 小结与展望

铁死亡是一种新的程序性细胞死亡形式，于2012年首次被发现。自从它被发现以来，与铁死亡相关的机制和信号通路得到了广泛研究，铁死亡的过程受到铁代谢、脂质代谢和众多信号通路的调控，在许多病理生理过程中发挥着重要的作用。肺癌是世界上最常见的肿瘤之一，尽管近年来医疗取得了令人瞩目的进展，但NSCLC仍然是肿瘤相关死亡的主要原因之一。目前对铁死亡的机制虽有初步了解，但在将其应用于临床治疗之前，还需要对如何调节铁死亡进行更具体的研究。随着对铁死亡机制研究的深入，越来越多的研究人员开始关注新兴的铁死亡诱导剂领域，其在肺癌治疗领域非常有前途。利用铁蛋白代谢相关基因可直接预测肺癌的预后。使用RNA和纳米粒子技术的靶向治疗也对诱导铁死亡有效。本文综述了铁死亡机制的进展以及它如何影响NSCLC。随着对铁死亡的更深入了解，它可能成为NSCLC的一种新疗法。