外泌体miRNA-124在颅脑创伤过程中表达及意义的研究进展

王 策 ，黄忻涛，闫青云，徐新娟，汪 易，杨亚军

颅脑创伤是指由突发机械力作用于头部而造成不同程度的急性脑损伤，目前仍是成年人死亡和残疾的主要原因，很多幸存者也因其残留着各种后遗症而影响其认知、感觉、运动和情绪等，生活质量大大降低[1-2]。临床上评估颅脑创伤病人病情严重程度及预后常采用格拉斯哥昏迷评分(Glasgow Coma Scale，GCS)、临床症状及影像学表现等，但在实践过程中，病人的意识水平可能被镇静药物、中毒等影响所掩盖，从而影响临床医生对病人做出准确的判断。尽管随着社会及技术的发展，颅脑创伤病人在支持治疗和康复护理等方面得到了改善，但目前仍无有效的方法对其进行诊断、评估病情及预测预后等，以降低颅脑创伤的死亡率并改善功能恢复[3]。有研究表明，颅脑创伤会引起血清外泌体miRNA的变化，这可能会对细胞间信号传导和颅脑创伤后的疾病进展产生重要影响[4]。血清或血浆miRNA已被报道为许多中枢神经系统疾病特异和敏感的生物标志物，包括颅脑创伤[5]。miRNA-124(miR-124)作为中枢神经系统内含量最丰富的特异性miRNA，有望成为一种新的血清生物标志物，来评估颅脑创伤的严重程度、改善预后及预测疾病进展。

1 颅脑创伤的特点及病理生理

在公共卫生领域中，颅脑创伤一直是全世界导致人类损伤性死亡和致残的主要原因。常见的颅脑创伤有脑震荡、脑挫裂伤、颅内血肿等，从而引发不同程度的意识、运动及感觉障碍。颅脑创伤已经成为全球疾病负担的第三大常见原因。据估计，全球每年约有1 000万人受到颅脑创伤的影响，尤其是儿童和青年人。有统计资料显示，我国的颅脑创伤病人数量远超世界各国，交通事故、跌倒、暴力因素等均是导致颅脑创伤的常见原因[6]。颅脑创伤的损伤一般可分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤是指机械外力对脑组织的直接冲击，包括脑挫裂伤、颅内出血、弥漫性轴索损伤等，这些损伤可导致细胞瞬间死亡，也正因此，颅脑创伤最初被定义为急性损伤综合征[7]。继发性损伤涉及一系列生物过程，即原发性损伤后的神经炎症反应、氧化应激、神经细胞的损伤、免疫反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏等这些过程及其潜在的分子机制形成了一个复杂而有序的网络，贯穿于颅脑创伤的整个过程，且继发性损伤是导致脑水肿、颅内高压及随后神经功能障碍的主要原因[8]。由于原发性损伤被认为无法在治疗上得到控制，因此，继发性损伤的治疗受到了更多的关注，控制和调节继发性脑损伤的发展可能有利于颅脑创伤的预后[9]。然而目前对于颅脑创伤的准确诊断、预测预后和临床治疗依旧受到较大的限制，许多研究人员为此进行了大量深入的研究，尤其是分子机制方面，以期获得分子生物标志物来反映其病理生理学特征，并对其进行干预治疗。

2 外泌体miRNA的特点及与颅脑创伤的关系

外泌体是一种可由多种细胞释放到细胞外的直径为30～150 nm的微小囊泡，几乎存在于所有的体液中(羊水、血液、尿液、脑脊液等)，具有高度的可调节性，并且可以参与细胞间的信号传递及信息交流等，包含多种蛋白质和脂质[10]。外泌体因其具有的脂质双分子层结构，表明了它不仅便于长期储存，而且可以很轻松地通过血脑屏障。因此，近年来对于外泌体的形成、转运、功能和临床应用等方面的研究明显增加，逐渐表明了外泌体在诊断和治疗中的应用，尤其是神经系统疾病中，具有广泛的可能性[11]。外泌体内包含有多种RNA，其中miRNA是最丰富的物种，稳定存在于许多哺乳动物细胞中。miRNA是一类长度17～25个核苷酸的功能性单链小RNA，通常位于内含子内，通过与靶基因的3′-UTR相结合，在调节基因或蛋白质表达过程中发挥关键作用[12-13]，参与细胞增殖、分化、凋亡等生命活动。miRNA可调节超过1/3人类基因的表达，其中单个miRNA可以靶向多个基因，一个基因也可以被一组miRNA所靶向[14]。越来越多的研究报道表明，miRNA不仅参与细胞周期正常的生物学过程如细胞分化凋亡、血管生成代谢等，还参与氧化应激、炎症反应、细胞增殖等基因的表达和调控等相关机制[15]，同时在突触形成、神经发生、分化和成熟等过程中也发挥着重要作用。2010年，Redell等[16]在颅脑创伤后检测到脑脊液和血液中miRNA表达水平的改变，并且检测到轻度和重度颅脑创伤(TBI)之间不同的miRNA表达谱，提示其作为损伤生物标志物的潜在用途。有人在颅脑损伤鼠模型的海马中检测到有31～50种miRNA表达的下调以及16～35种miRNA表达的上调，这些miRNA参与细胞分化、增殖等功能。有研究表明miR-21可以通过靶向调节抑癌基因(PTEN)、血管内皮生长因子(VEGF)基因等，激活血管生成素-1(Ang-1)/酪氨酸蛋白激酶受体2(Tie-2)和蛋白激酶B(Akt)信号传导，从而促进颅脑损伤和脑卒中后神经元轴突的生长[17]；另外，也有研究指出，miR-146a被认为是炎症的负性调节因子，可以由核转录因子-κB(NF-κB)激活诱导，而后通过抑制白细胞介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的表达来反馈该途径，从而降低了NF-κB的活化及T细胞的黏附，进一步抑制炎症反应。因此，miR-146a在各种神经系统疾病中的上调提示着机体正处于抑制炎症并恢复稳态的状态下[18]。

miRNA在癌症研究方面已经取得了长足的进步，在临床试验中miRNA已经被用作诊断、治疗和预测预后的癌症生物标志物。颅脑创伤是一种复杂的生理过程，涉及多种病理生理机制，损伤后的脑组织会发生一系列的病理生理变化(包括缺血缺氧、炎症、应激反应、血管生成、神经发生等)，而在这一系列过程中，miRNA已被指出具有特征性的改变，并参与继发性脑损伤过程，如促进神经元再生和凋亡，减轻血脑屏障(BBB)的渗漏，减少炎症反应等方面。基于此，miRNA作为中枢神经系统内最具特异性和敏感性的生物标志物之一，极有可能成为一个潜在靶点，在颅脑损伤后的诊断、评估病情及干预治疗等方面发挥重要作用。

3 外泌体miR-124在神经系统组织中的表达

Lagos-Quintana等[19]在2002年的研究中首次发现miR-124在小鼠的脑组织中高表达，并且认为其在小鼠、大鼠和人类之间具有同源性。近10余年来，人们对于miR-124的认识也在不断加深。在哺乳动物的神经系统内，miR-124是含量最丰富的miRNA，约占成年人大脑miRNA总量的25%～48%，且在除了脑垂体以外的脑组织中特异性高表达，尤以大脑皮层为著[20]。miR-124的高表达提示其在中枢神经系统中有着举足轻重的作用，也因此成为神经生物学最受关注的miRNA之一。miR-124有miR-124-1、miR-124-2、miR-124-3三条未成熟的前体序列，分别位于染色体的8p23.1、8q12.3和20q13.33上[20]，他们被双链专一性RNA内切酶Dicer酶剪切后成为成熟的miR-124序列，然后与下游靶基因序列结合，从而发挥生物学效用[21]。miR-124的配对方式使其能够识别并作用于数百种miRNA，通过实用miRNA分子靶基因预测数据库对人类miR-124靶基因进行预测并结合韦恩分析，预测不同数据库中的256个靶分子，其中孤儿核受体4A1(NR4A1)、内质网应激相关蛋白1(SERP1)、Rho相关激酶(ROCK1)等在脑发育及神经损伤修复过程中起着非常重要的作用[22]。近年来，随着研究的进展，miR-124与中枢神经系统疾病之间的关系变得越来越明确，miR-124逐渐被探索到在氧化应激、炎症调节、血管再生、神经发育、免疫反应、轴突再生与修复等一系列过程中发挥重要作用[23]。

4 外泌体miR-124参与颅脑损伤可能的机制

4.1 miR-124促进中枢神经系统发育，并参与调控颅脑损伤后神经发生与损伤修复

4.1.1 促进神经元的分化与成熟 早在2005年多项研究就已报道，miR-124作为中枢神经系统含量丰富的miRNA，优先在神经元中表达，并且发现其表达在中枢神经系统发育过程中逐渐增加并与神经元的成熟相平行[24]。与启动子结合的RE-1沉默转录抑制物(REST)可以降解非神经性转录产物，而miR-124则可以拮抗REST的作用。在神经元诱导的过程中，miR-124的表达与REST形成负反馈调控网络，REST因受到调控呈低表达，相反miR-124却得以释放出来得到表达，进一步参与神经祖细胞抑或是非神经样细胞向神经元的转化[25]。多聚嘧啶核苷酸序列结合蛋白(PTBP)是一种选择性剪切调控蛋白，具有多种亚型，有研究显示，PTBP1可以抑制PTBP2，而miR-124却又能够抑制PTBP1，使得PTBP2的表达升高，进而使蛋白的表达朝着神经元方向进行，并使神经干细胞向着神经元方向分化[26]。颅脑损伤后的组织损伤过程在神经保护及修复机制中演变，引发对损伤一系列的生化反应，导致神经元修复或凋亡细胞凋亡等，miR-124可以促进神经元的分化与成熟，有望成为神经损伤后修复的作用靶点。Yang等[27]的研究利用修饰的外泌体将miR-124靶向性地传递到缺血皮质，发现miR-124促进了缺血后大脑皮层的神经发生。

4.1.2 促进神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖与分化 神经干细胞是一种多能、未分化的细胞，具有向神经细胞和胶质细胞分化的潜能。在哺乳动物中枢神经系统中，神经干细胞主要存在于海马区及室管膜下区，不仅具有神经元及神经细胞再生的能力，还可以迁移并整合入受损伤的脑组织，对颅脑损伤造成的神经结构、组织损伤等进行修复[28]。Notch信号通路通过调控靶基因的表达来影响细胞的增殖、存活和凋亡，在神经干细胞的维持与神经再生中起关键作用。有报道称，在体外环境下，miR-124以DLL4为作用靶点，抑制Notch信号通路活化从而促进神经干细胞的增殖与向神经性分化[29]，提示miR-124能够参与Notch信号通路来发挥对神经干细胞的调控作用。在Wnt/β-catenin信号通路中，肿瘤抑制因子β1连环蛋白抑制基因1(DACT1)已被阐明可以通过降解B-连环蛋白来阻断下游基因的转录，并且该通路已被证明与基质细胞(ESCs)的自我更新和神经元分化有关[30]。miR-124可以通过与DACT1的3′UTR片段结合负调控DACT1的表达和激活Wnt/β-catenin信号通路来促进神经干细胞的增殖和向神经元分化。Yang等[31]通过对颅脑损伤后大鼠海马神经发生的研究表明，miR-124可以通过促进颅脑损伤后小胶质细胞M2极化，进而促进海马神经干细胞的增殖和神经元分化，改善及恢复脑损伤后的神经功能。神经干细胞具有生成和再生大脑的能力，miR-124可以作用于其相应的靶点，在NSCs的存活、扩增和分化中起调节作用，并促进多种神经干细胞或祖细胞向神经元方向分化，表明颅脑损伤后通过神经损伤修复细胞来干预治疗这一方式的可能性，为促进颅脑损伤后的神经元再生和神经功能恢复提供了有效的靶向生物治疗思路。

4.1.3 促进颅脑损伤后神经元突起的再生与修复 神经元的突起不仅可以将胞体发出的冲动传递给另外一个神经元，同时也是神经元接收信号的重要门户。有研究表明，在神经发育过程中，miR-124基因的缺失使得小鼠出现轴突生长缺陷、脑体积减小甚至神经细胞死亡[32]，适度的miR-124表达有利于损伤后的轴突修复。颅脑损伤后发生的一系列病理生理过程导致神经元大量损伤及神经功能严重缺失，轴突再生困难，因此，促进受损的神经元恢复及轴突的正确生长连接，已成为治疗颅脑损伤并改善预后的一个研究热点。苏鑫洪等[33]在小鼠皮层神经元机械损伤模型初步研究中表明了在颅脑损伤后的病理状态下，适量的miR-124高表达，更有利于损伤后轴突的修复。Wang等[34]证明了miR-124可以促进受损神经元突起的生长，包括神经突起的分支数目和总长度增加。组蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)和 Ras家族同源性生长相关基因(RhoG)可能是miR-124促进神经元突触延伸的一个靶点：HDAC5可抑制C57/BL小鼠皮层神经元突触的生长和延伸，而miR-124能够抑制HDAC5的表达，因此，当miR-124高表达时可以促进神经元突触和轴突的生长[35]；在吞噬和细胞运动蛋白(ELMO)/Dock180/Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)的通路中，大鼠海马神经元内RhoG的活性增强可以抑制突触形成与突起延伸，而miR-124则可与RhoG的3′UTR结合，抑制RhoG的表达，从而促进突触形成与突起延伸的发生[36]。这些都为进一步研究颅脑损伤后的神经干预治疗提供了基础。

4.2 miR-124参与颅脑损伤后缺血缺氧调节 大脑消耗了全身20%的氧气摄入量，因此，脑血供的丧失(血管断裂或低灌注等)会导致严重的神经病理学影响。颅脑损伤后因脑血管受到挤压或牵拉所引起的痉挛、管腔狭窄等会导致其供血区域缺血缺氧的状态，这种改变如不能及时缓解，则将进一步导致创伤性脑梗死的发生。近年来，研究者已经确认缺血区的新生血管形成是颅脑损伤后神经修复与再生的关键因素，且外泌体miR-124水平与脑梗死体积、血清白细胞介素-6水平及美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分呈正相关[37]，随着研究的不断深入，有研究表明外泌体介导的miRNA转运可有效地将miR-124转运至缺血区，并通过促进神经祖细胞在缺血部位获得神经元表型，从而改善颅脑损伤[38]；随后Sun等[39]在研究miR-124对剥夺了氧气和葡萄糖后诱导细胞凋亡相关蛋白的影响中发现，缺血区域的miR-124表达水平较未缺血区域显著升高。颅脑损伤后的脑组织缺血缺氧是导致继发性损伤的一个关键点，各项研究均显示miR-124在缺血性脑损伤的发病机制和病理过程中起着重要作用，低灌注缺氧会引起miR-124表达的改变，继而作用于其相应靶点来改善脑损伤的恢复。

4.3 miR-124参与调控颅脑损伤后的炎症反应 颅脑损伤后的病人明显存在着氧化应激和炎症反应，神经炎症反应在中枢神经系统抵御病原体侵袭和修复组织损伤过程中起着重要作用，也提示着颅脑损伤病人的预后。虽然炎症本身导致了继发性颅脑损伤的扩大及不良反应，但其也介导了颅脑损伤后的神经保护与修复机制。因此，适度的炎症反应对于机体而言是有益处的，在一定程度上对损伤的脑组织有保护作用[40]。①哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在颅脑损伤后免疫炎症反应的调节中起着重要作用，而磷酸二酯酶4B(PDE4B)是唯一与mTOR信号相关的合格基因，并且可以被miR-124所靶向。miR-124可以通过直接靶向PDE4B来抑制mTOR信号的活性，从而抑制下游靶点p-4E-BP1和p-P70S6K的磷酸化水平，减少促炎细胞因子的释放以及促进抗炎细胞因子的表达来抑制神经元炎症[41]。②在颅脑损伤发生后，损伤细胞所释放的损伤相关分子模式(DAMP)短时间内即可与小胶质细胞表面的Toll样受体和Nod样受体结合，损伤处激活的小胶质细胞具有M1和M2样混合表型[42]，分别被认为与神经系统促炎及抗炎过程相关。miR-124可以通过调控Toll样受体通路，促进小胶质细胞从M1向M2表型分化，调控颅脑损伤后过度的炎症反应，从而起到神经保护的作用[43]。此外，miR-124还可以通过转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBP-α)途径促进小胶质细胞向抗炎M2表型分化[44]，以及通过有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(MEKK)/NF-κB信号通路介导小胶质细胞的炎症反应[45]，从而发挥神经保护及调控炎症过程的作用。③miR-124可通过胆碱能抗炎通路以及迷走神经在巨噬细胞中发挥抗炎作用。具体过程为迷走神经作用于脾T细胞，脾T细胞产生乙酰胆碱，乙酰胆碱与巨噬细胞上的α7-烟碱乙酰胆碱受体结合，以促进抗炎极化[46]。在这些巨噬细胞内，miR-124可以通过降低转录激活因子3(STAT3)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转化酶来驱动抗炎极化，继而抑制炎性因子的释放，发挥胆碱能抗炎作用来调节炎症反应。由此可见，miR-124作为脑内含量最丰富的miRNA，在神经元和胶质细胞信号传递中发挥着重要作用，调控着炎症反应[47-48]，并参与多个病理生理过程，提示其具有协助早期诊断、预测预后及成为治疗靶点的潜力。

miR-124作为在中枢神经系统特异性高表达的miRNA，随着研究的不断深入，已逐渐展现出其广泛的调节功能及对疾病发生发展的复杂效应，因而已成为最受关注的神经生物学研究热点之一，为神经系统疾病的诊断和治疗提供了新思路。颅脑损伤后miR-124的动态表达变化及相关作用机制已被初步阐明或证实，表明了其作为颅脑损伤特异性诊断标志物、干预治疗或预测预后的巨大潜力。然而，对于miR-124在颅脑损伤的诊疗领域的研究才刚刚起步，可能还有许多潜在的机制未被发现，需要更多、更深入的研究来进一步明确。

5 小 结

颅脑损伤是一种广泛存在的中枢神经系统疾病，其致死率及致残率仍居全身创伤性损伤的首位。传统的影像学检查[CT或磁共振成像(MRI)等]及评分标准在临床实践中通常用于诊断和分类颅脑损伤，但其敏感程度和精度往往受限，因此，亟须一种普遍存在且易获得的分子生物学标志物来反映疾病的病理生理学特征，这对于确定颅脑损伤病人的损伤程度及预测预后等非常重要。近年来，有关外泌体miR-124的研究越来越多，人们逐渐认识到其作为各种神经系统疾病细胞中相互交流和交换各种生物信息的主要载体，在颅脑损伤后的诊断、预测预后及进一步临床治疗中的相关分子机制也逐渐显现出来，有望作为一种新型生物标志物发挥重要作用。

在颅脑损伤后的损伤修复机制中，大量的相关因子参与其中建立联系并发挥作用，因此，不必仅局限于某单个miRNA，其可能与一组相关因子建立联系，共同发挥作用。为了开发预防或改善颅脑损伤后的长期损伤和缺陷的治疗靶点，需要进一步明确miR-124与颅脑损伤发病机制之间关系的确切分子机制，从而更准确地为其作为生物标志物和未来治疗靶点、进一步理解颅脑损伤的发生、发展提供全新的视角。