外泌体对动物肠道健康的影响及其研究方法

魏文焯，梁振华，吴 艳，刘静波，皮劲松，张 昊

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010)

外泌体是由细胞内多囊泡体分泌的富含生物活性物质的细胞外囊泡，其主要形成机制为分泌细胞质膜内陷形成早期核内体，早期核内体经体内分选复合物调控形成多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合形成外泌体[1-2]。外泌体中的生物活性物质主要包括核酸(mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)、蛋白质以及脂质等物质[3]，且外泌体不含线粒体、内质网等细胞器结构[4]。外泌体主要在细胞通讯、疾病诊断及机体免疫应答等方面发挥作用，已成为生命科学领域的研究热点[5-6]。目前，外泌体的相关研究主要集中在模式动物和人类疾病方面，而与动物肠道健康相关的外泌体研究较少。为此，作者梳理了肠细胞源、非肠细胞源外泌体对畜禽肠道健康的影响以及外泌体的研究方法，以期为后续研究提供参考。

1 肠细胞源外泌体对畜禽肠道健康的影响

肠道细胞包括上皮细胞、潘氏细胞、巨噬细胞与淋巴细胞等，它们直接暴露于微生物、外来抗原与消化道内容物中，使维持肠道内环境稳态成为一个复杂且具有挑战性的过程。肠道内环境稳态失衡，就会引发肠道炎症等疾病，从而对机体造成损伤。肠道内环境稳态的平衡依赖于细胞外因子、细胞外囊泡和肠道屏障防御之间的共同作用[7]。细胞外囊泡主要包括外泌体、微粒、凋亡小体和癌小体，它们不仅负责细胞间的通讯工作，同时也是细胞与机体之间的通讯器[8]。因此，肠道菌群与肠道细胞之间的细胞外囊泡通过相互沟通，共同维护肠道内环境稳态，对机体健康至关重要[9]。

1.1 肠上皮细胞源外泌体对畜禽肠道健康的影响

小肠上皮细胞是肠道的重要组成部分，在肠道免疫调节中发挥重要作用，尽管它们不是专业的抗原呈递细胞，但它们具有主要组织相容性复合体(histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ[10]。有研究表明，小肠上皮细胞可分泌外泌体，且外泌体与亲代细胞含有相同的免疫调节分子与MHCⅠ和MHCⅡ。小肠上皮细胞分泌的外泌体通常从细胞的顶部或基底外侧释放，可携带A33抗原，A33抗原被认为是小肠上皮细胞外泌体的标志物[10]。外泌体可与树突状细胞相互作用，通过免疫调节信号刺激具有耐受性的树突状细胞、调节T细胞和巨噬细胞成熟。Ayyar等[11]研究表明，小肠上皮细胞外泌体通过分泌膜联蛋白A1、整合素、细胞因子和趋化因子帮助维持肠道免疫稳态，诱导耐受性免疫反应，还可分泌髓过氧化物酶来保护肠道免疫屏障免受细菌入侵，髓过氧化物酶会产生抗细菌的氧化应激。综上所述，肠上皮细胞源外泌体可携带生物活性物质或与树突状细胞相互作用等方式维持肠道内环境稳态。

1.2 肠道免疫细胞源外泌体对畜禽肠道健康的影响

肠道是机体的消化器官，也是机体重要的免疫器官，处于机体免疫防御的最前线。肠道内有多种免疫细胞，其中包括树突状细胞、肠道T细胞与先天淋巴样细胞等[12]。据报道，肠道内多种免疫细胞均可分泌外泌体，在维持肠道内环境稳态中扮演重要角色[13]。树突状细胞是肠道免疫系统的专职抗原呈递细胞，可在感知抗原时启动免疫反应，根据亲本树突状细胞的阶段和成熟，树突状细胞衍生的外泌体可能具有免疫刺激/抑制作用[14]。中性粒细胞源外泌体含有miR-23a、miR-155和髓过氧化物酶，被肠上皮细胞吸收后可诱导双链断裂并减缓结肠上皮的伤口愈合[15]。此外，Ayyar等[11]研究发现，肠道免疫细胞源的外泌体通过诱导免疫耐受和触发调节性T细胞激活而抑制T辅助细胞来促进抗炎反应，经外泌体处理的免疫细胞可进一步分泌外泌体，从而促进抗炎反应。综上所述，肠道免疫细胞源外泌体可通过分泌miRNA、髓过氧化物酶或激活调节性T细胞等途径减缓肠道炎症反应。

2 非肠源外泌体对畜禽肠道健康的影响

肠源外泌体主要通过细胞间的旁分泌，在肠细胞内部发挥作用。而非肠源外泌体主要通过外源添加等方式影响肠道细胞间通讯与相关基因表达。

2.1 外泌体与肠道菌群

肠道内微生物菌群构成机体肠道的微生物屏障。正常情况下，肠道微生态处于平衡状态，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而肠道微生物稳态打破会造成各种疾病发生，影响机体健康。外泌体是一种内源性的调节物质，可影响肠道菌群的组成与生长。Zhou等[14]研究表明，对C57BL/6型小鼠分别饲喂牛乳外泌体缺乏饲粮(exosome-and RNA-depleted，ERD)与牛乳外泌体充足饲粮(exosome-and RNA-sufficient，ERS)后，发现牛乳外泌体改变了小鼠盲肠中的微生物群落，喂食ERD与ERS的小鼠盲肠中，微生物菌群中3个门、7个科和52个操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)出现显著差异。其中，15和47周龄饲喂ERS的小鼠肠道中软壁菌门的丰度是饲喂ERD小鼠的3倍，7和47周龄饲喂ERS的小鼠肠道中毛螺菌科的4个OTUs丰度高于饲喂ERD小鼠的2倍。Teng等[16]研究发现，植物来源的外泌体纳米颗粒可以被被肠道微生物群吸收，并含有改变微生物组成和宿主本身的RNA。此外，Yu等[17]用牛乳外泌体与大肠杆菌、乳酸菌混合培养，发现大肠杆菌与乳酸菌的生产速率得到了显著提高。上述研究表明，外源外泌体可参与肠道菌群与机体间的相互作用，并改变机体肠道菌群的组成与丰度。

2.2 外泌体与肠道干细胞的增殖凋亡

外界环境的刺激可使动物发生应激反应，导致肠道上皮细胞发生凋亡，但肠上皮细胞凋亡失衡会导致肠道通透性和屏障功能障碍增加，导致多种急慢性肠道疾病[18]。因此，促进肠上皮细胞的增殖分化，对维持肠道屏障功能的完整性具有重要作用。外泌体中含有多种生物活性物质，可使肠道干细胞的增殖分化能力显著提高。研究表明，肠肌成纤维细胞来源的外泌体中的miR-125a/b可通过靶向骨髓细胞白血病1基因(myeloid cell leukemia-1，MCL1)的3′-UTR区域，调节大鼠肠上皮细胞的增殖[19]。在缺氧条件下，牦牛乳源外泌体显著促进小肠上皮细胞中氧敏感脯氨酸羟化酶-1(prolyl hydroxylase，PHD1)的表达，降低缺氧诱导因子-α及其下游靶血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，并降低p53蛋白的含量，从而促进缺氧状态下小肠上皮细胞的增殖[20]。Zhou等[21]研究发现，人乳源外泌体可促进肠道发育，其机制可能为外泌体中的circRNA竞争性结合miRNA，调控VEGF信号通路，从而促进肠上皮细胞的增殖与迁移。赵伟[22]在研究肠神经系统发育异常时发现，大鼠肠神经嵴干细胞源的外泌体可抑制大鼠肠神经嵴干细胞的增殖，并诱导其凋亡，机制可能为外泌体中circCDR1as的表达下调，从而抑制大鼠肠神经嵴干细胞增殖与迁移，提示外泌体circRNA在维持肠道内环境稳态中扮演重要角色。Xie等[23]通过构建小鼠肠道损伤模型，在体内体外均证明猪乳源外泌体可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠肠道上皮细胞凋亡，提高肠道紧密连接蛋白的表达，降低TLR4/NF-κB信号通路激活，缓解小鼠的肠道损伤。Chen等[24]研究表明，猪乳源外泌体可显著促进尾型同源盒转录因子2(CDX2)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，抑制参与肠道增殖的p53基因表达，并显著提高小鼠肠道组织的绒毛高度、隐窝深度和绒毛长度与隐窝深度的比值。此外，Melnik等[25]研究发现，外泌体中miR-21可调控mTOR1通路，促进肠道干细胞的增殖。综上所述，外泌体中丰富的生物活性物质可以调控机体中相关基因与蛋白质的表达，抑制肠道上皮细胞的凋亡，促进肠道干细胞的增殖，保护肠道屏障功能的完整性。

2.3 外泌体与肠道炎症

炎症是生物组织受到某种刺激如外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程，涉及到多种类型的免疫和非免疫细胞的参与[26]。现阶段研究表明，外泌体对肠道炎症具有显著的抑制作用。Deng等[27]利用M2巨噬细胞源的外泌体，成功验证了外泌体中miR-590-3p可抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β和白细胞介素-6的诱导，并通过靶向大肿瘤抑制激酶1(large tumor suppressor kinase 1，LATS1)激活YAP/β-catenin调节的转录来减少小鼠炎症信号并促进小鼠肠上皮细胞再生。炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种特发性慢性疾病，其特点为肠道黏膜反应异常、肠道上皮细胞紊乱与肠道微生物环境破坏等[28]。Liu等[29]研究发现，人骨髓间充质基质细胞源的外泌体(mesenchymal stromal cells exosomes，MSC-Exos)可显著减轻各种IBD模型的结肠炎，保持肠道屏障的完整性。其机制可能为MSC-Exos作用于结肠巨噬细胞，而MSC-Exos处理的小鼠与未处理的小鼠相比，来自结肠的巨噬细胞对炎症再刺激具有明显的抵抗力。Wang等[30]利用小鼠构建了葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的IBD模型，发现人脐带间充质干细胞衍生的外泌体(hucMSC-exosomes，hucMSC-Ex)可通过抑制miR-326的类泛素化修饰在小鼠IBD模型中缓解DSS诱导的IBD。此外，Miyake等[31]利用小鼠构建了坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)模型，在体内与体外均验证了人乳源外泌体可减轻LPS诱导的NEC。在体外，验证了人乳源外泌体可减轻缺氧与LPS处理所诱发的肠道炎症；在体内，发现人乳源外泌体可显著改善NEC诱导的肠道黏膜损伤、肠道炎症反应与肠道黏液的产生。综上所述，外泌体可通过调控体内基因、蛋白质与炎症因子的表达，从而抑制相关炎症信号通路，达到缓解动物肠道炎症的目的，其中某些miRNA在外泌体缓解肠道炎症的过程中扮演重要角色，未来可能成为治疗动物肠道炎症的切入点。

3 外泌体的研究方法

3.1 外泌体的分离方法

随着外泌体相关研究的深入，其生物学功能的潜在应用价值被不断挖掘。外泌体的分离过程对外泌体的研究至关重要，然而外泌体的异质性却加大了分离外泌体的难度。此外，目前大多数的分离技术都无法将具有相似生物物理特性的脂蛋白和非内体途径的细胞外囊泡完全分离出外泌体，导致外泌体纯度低。因此,如何高效分离纯化外泌体，是外泌体相关研究的关键。目前常用的分离方法共有5种，分别为超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法与磁珠免疫法。

3.1.1 超速离心法 超速离心法是目前应用最广泛的分离技术之一，超速离心法主要是根据原始溶液中各组分的大小和密度差异提取所需组分，适用于沉降系数差异较大的大剂量样品组分的分离[32]。超速离心法主要分为3步：①低速离心去除死亡细胞与组织碎片：以300×g离心10 min，取上清；②中速离心去除大尺寸的细胞外囊泡：以2 000×g离心10 min，取上清；③高速离心分离外泌体：10 000×g离心30 min，取上清，100 000×g，在4 ℃下持续离心90 min，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100 000×g离心90 min。超速离心法所提取的外泌体数量多，但耗时长，回收率不稳定，且纯度较低。因此，超速离心法多与密度梯度离心法联合使用。Gu等[33]研究外泌体对造血功能的影响时利用超速离心法成功从细胞悬液中分离出外泌体。

3.1.2 密度梯度离心法 密度梯度离心法通常与超速离心法联用，以提高外泌体的纯度。在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13～1.19 g/mL的密度范围富集[34]。 密度梯度离心法所提取的外泌体纯度高，但蔗糖溶液的高黏度会降低外泌体的沉降速度，导致沉降时间延长。Liu等[35]利用密度梯度离心法与超速离心法结合，成功提取小鼠脂肪源外泌体。

3.1.3 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法通常以聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)为介质，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下分离外泌体。聚合物沉淀法早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关[13]。聚合物沉淀法操作简单，分析时间短，适用于大剂量样品的处理，但纯度和回收率较低，可能产生假阳性，产生的聚合物难以去除，不利于后续功能实验分析。Tassetto等[36]利用聚合物沉淀法与超速离心法结合，成功提取果蝇血细胞外泌体，并利用纳米颗粒示踪分析与电子显微镜法对外泌体进行鉴定。

3.1.4 尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱(size-exclusion chromatography，SEC)是基于大小而非分子质量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱[37]。SEC的提取速度快、操作简单、成本低廉。所分离出的外泌体结构完整，大小均匀，其生物学特性不会受到明显的不利影响，但可能会掺杂其他类似大小的颗粒，导致纯度降低。Tóth等[38]利用尺寸排阻色谱法成功从血浆中分离出外泌体。

3.1.5 磁珠免疫法 磁珠免疫法是利用外泌体表面的特异性标记物(如CD9、CD63、CD81蛋白)，用配体磁珠与之孵育结合，即可将外泌体吸附并分离出来[39]。磁珠法具有特异性强、纯度高、不影响外泌体形态完整等优点，但磁珠免疫法不适合从大量样品中提取外泌体，磁珠与抗体较为昂贵，保存条件苛刻，难以广泛普及。

3.2 外泌体的鉴定方法

3.2.1 电子显微镜法 电子显微镜法是利用扫描电镜或透射电镜，观察不同大小的外泌体的形态和结构[40]。扫描电镜是用能量为1～30 kV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像，获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。透射电镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射，形成明暗不同的影像。电镜法可直接观察外泌体的形态与结构，用于鉴别不同类型、不同大小的外泌体，但样品的处理与制备较为复杂。Chen等[41]研究种利用电子显微镜法对所分离的外泌体进行结构分析，观察发现分离的外泌体均为盘状和杯状结构的椭圆形小泡，直径为30～150 nm。

3.2.2 纳米颗粒示踪分析 纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)是一种快速发展的热门光学粒子跟踪技术，用于实时监测粒子的粒径分布和浓度[42]。其方法为将收集的外泌体样品用PBS稀释后，用注射器注入纳米颗粒示踪分析仪，激光照射外泌体中的粒子，通过粒子散射光并进行布朗运动，可以记录每个粒子的运动轨迹，并可以确定粒子的扩散率和平均速度，利用相应的计算公式即可算出样品的浓度与流体力学直径[4]。该方法样品制备简单，检测速度快且准确，但所测外泌体直径大小的下限为70 nm。研究表明，肠源外泌体直径主要集中在60～150 nm范围内[43]，可结合蛋白质印迹法或电镜法检测直径较小的肠源外泌体。Chen等[41]利用NTA鉴定滑膜组织外泌体时发现，外泌体主峰值均在100～120 nm，且浓度均>1×1010/mL。

3.2.3 Western blotting法 外泌体表面有许多特异性蛋白，利用相应的蛋白抗体与之结合，进行SDS-PAGE分离、转膜，进行显影检测外泌体特异蛋白的表达量[44]。Western blotting法特异性高，操作技术成熟，在鉴定不同细胞来源的外泌体时，需要不同的蛋白抗体，肠源外泌体表面抗原与标志物主要有A33抗原、膜联蛋白A1与CD63等[11]。Chen等[41]通过Western blotting方法检测外泌体生物标志物蛋白CD9、CD63和Flotillin-1时发现，3种外泌体标志蛋白均在检测样品中高度表达。

3.2.4 流式细胞术 利用外泌体表面特异性标志物相应的抗体进行标记，通过流式细胞仪检测其阳性表达，也可对外泌体进行验证[45]。如染色后的外泌体溶液加入分支聚乙烯亚胺，37 ℃孵育15 min，之后超速离心去除分支聚乙烯亚胺，然后加入金纳米颗粒，轻柔重悬后置于培养箱中60 min，加入别藻蓝蛋白DNA染料，室温孵育15 min后用流式细胞仪检测，APC阳性的颗粒即为所需检测的外泌体。此法检测速度快，可分析外泌体的大小与体积，所需样品浓度低，但不能分辨较小的外泌体。Teresa等[46]利用流式细胞术鉴定间充质基质细胞源外泌体时发现，样品表面标志性蛋白CD90、CD34与CD63等均有表达。

3.3 外泌体研究的生物信息学工具

3.3.1 EVmiRNA数据库 EVmiRNA数据库(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA)是一个专用于细胞外囊泡的miRNA数据库，里面包括miRNA表达谱、miRNA相关药物、miRNA调控途径、miRNA功能以及相关出版物。收录了17种器官或疾病中的462个细胞外囊泡miRNA测序样本及miRNA表达图谱。EVmiRNA提供了3个功能模块：①不同来源(如血液、母乳等)的miRNA表达谱和样本信息；②在不同细胞外囊泡中特异表达的miRNA，有助于生物标志物的识别；③miRNA注释，包括miRNA在EV中的表达，miRNA途径的调控，以及miRNA的功能和出版物[47]。Zhang等[48]利用EVmiRNA数据库对比B细胞源外泌体与K562白血病的外泌体中差异表达的miRNA，结果表明B细胞源外泌体中差异表达的miRNA数量为287个，K562白血病的外泌体中差异表达的miRNA为176个。

3.3.2 exoRBase数据库 exoRBase数据库(http:∥www.exorbase.org/exoRBaseV2/toIndex)是从人血液外泌体的RNA-seq数据分析得出的circRNA、lncRNA和mRNA的存储库。exoRBase数据库旨在收集和表征人血外泌体中的所有长RNA种类来提供注释，其中包括表达水平和可能的原始组织，识别血液外泌体中的分子标记，并将触发新的循环生物标志物发现以及对人类疾病的功能预测[49]。

3.3.3 ExoCarta数据库 ExoCarta数据库(http:∥www.exocarta.org/)是外泌体标志物综合数据库，针对外泌体中鉴定出的蛋白质和RNA分子，收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊、豚鼠、果蝇、马、穴兔、牛在内的几个物种共286个研究结果。除此之外，ExoCarta数据库的一个典型特点就是具有外泌体蛋白动态的蛋白与蛋白之间相互关系网以及生物学通路[50]。Haraszti等[51]的研究中利用ExoCarta数据库预测并成功验证外泌体标志物CD81与CD9。

3.3.4 Vesiclepedia数据库 Vesiclepedia数据库(http:∥www.microvesicles.org/)是一个EVs分子(脂质、核酸和蛋白质)的数据库，目前包含来自于文献中发表的341个独立研究的35 264个蛋白，18 718个mRNAs，1 772个miRNAs、342个脂质条目，数据库中的细胞外囊泡包括凋亡小泡、外泌体、微粒体与微囊泡等，还可以根据物种、囊泡、分子和样品类型浏览和检索[52]。

3.3.5 exRNA Atlas数据库 exRNA Atlas数据库(https:∥exrna-atlas.org/exat)是细胞外RNA通讯联盟所开发的数据库，该信息库包括人类和小鼠生物流体的小分子RNA测序和实时荧光定量PCR衍生的exRNA图谱。其中包括了脑脊液、唾液、血清、血浆和尿液来源的5 309例exRNA-seq以及实时荧光定量PCR数据，同时网站还提供了适用于exRNA研究的分析工具[53]。

4 展 望

近年来，由于外泌体具有来源广泛、含有多种生物活性物质及可跨物种使用等优点而成为生命科学领域的研究热点。但当前外泌体相关研究也存在一些问题：①目前外泌体相关研究主要集中在人疾病方面，有关外泌体对动物肠道健康的研究较少；②目前研究外泌体所使用的主要是模式动物，而以畜禽作为动物模型的研究较少；③目前外泌体的分离方法基本无法获得单一的外泌体，所分离的样品中包含有其他细胞外囊泡，因此需要改进现有的分离方法，以便对外泌体进行独立研究。

外泌体可在细胞通讯、机体免疫应答及细胞分化等过程中发挥作用，调节机体内环境稳态。鉴于外泌体的重要作用，进一步探索外泌体携带功能成分在肠屏障功能维持、肠黏膜损伤修复、肠道疾病中的作用及相关调控机制，可为畜禽肠道健康研究提供新思路，也为畜禽肠源性问题的有效解决提供新方案。