基于HPLC-MS的消岩汤在正常大鼠体内药动学研究

牛小玉，杨佩颖，孔凡铭，韩增风，查春媛，李小江，贾英杰，孙彬栩*

基于HPLC-MS的消岩汤在正常大鼠体内药动学研究

牛小玉1, 2，杨佩颖1, 2，孔凡铭1, 2，韩增风1, 2，查春媛1, 2，李小江1, 2，贾英杰1, 2，孙彬栩1, 2*

1. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300381 2. 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381

研究消岩汤中的有效成分并分析其在正常大鼠体内的代谢情况，从而初步探究消岩汤中抗肿瘤有效成分及其代谢规律。取12只雄性Wistar大鼠随机分为实验组及对照组，实验组ig消岩汤浓缩液，对照组ig单药黄芪（消岩汤中君药）浓缩液；给药后于不同时间点目内眦取血0.5 mL，采用液质联用（LC-MS）技术测定大鼠体内不同时间点黄芪甲苷、咖啡酸的浓度，得血药浓度-时间数据，采用DSA 2.0软件计算血浆药动学参数。实验组大鼠血浆中黄芪甲苷的消除速率常数（）、清除率（CL/F）均小于对照组（＜0.05、0.01），消除半衰期（l/2β）、表观分布容积（V/F）、max、药时曲线下面积（AUC）均大于对照组（＜0.05、0.01、0.001），两组的达峰时间（max）相同。实验组大鼠血浆中咖啡酸的CL/F小于对照组（＜0.01），l/2β、V/F、AUC、、max均大于对照组（＜0.05、0.01、0.001）。消岩汤能够促进其抗肿瘤成分黄芪甲苷、咖啡酸的吸收代谢。

消岩汤；药动学；黄芪甲苷；咖啡酸；液相色谱-质谱联用法

天津中医药大学第一附属医院贾英杰教授基于浊邪致病，提出癌浊理念及以“黜浊培本”为主的治癌法则[1]。认为正气亏虚是癌瘤发生的核心，在此基础上加之致癌因素的刺激，导致机体脏腑失调，三焦气化失司，从而内生浊邪。浊邪易阻碍气机升降，影响气血运行，运行不畅则生成瘀浊、浊毒等病理产物，邪浊胶结难化，久羁为患，变生“癌浊”，最终发为癌瘤[2]。贾英杰教授秉承“黜浊培本”治癌理念，创抑瘤验方——消岩汤[3]。消岩汤以“扶正与祛邪相结合”为主[4]，方中以黄芪、太子参为君，治以益气养阴，扶正抗癌；夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草清热解毒抗癌；郁金、姜黄行气散结祛瘀；蜂房祛风、攻毒、止痛，以搜剔脉络中之瘀毒[5]。全方配合使用，扶正祛邪兼具，充分体现了中医整体观念。临床应用消岩汤能够起到稳定原发病灶、阻止远处转移等作用，配合放化疗应用疗效更佳，同时能够改善机体免疫力、减轻放化疗不良反应，从而提高患者治疗依从性，改善患者生存质量[6-8]。

既往以“消岩汤临床疗效”为基础，对其治疗恶性肿瘤的药效与机制从宏观和微观的角度进行了初步研究。研究结果显示，消岩汤在临床上治疗肺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、消化道及妇科恶性肿瘤等均具有较好的疗效[9]。在配合放化疗使用时有明显的减毒增效作用，用药安全，无不良反应发生。同时，研究还显示，实验动物应用消岩汤后，免疫功能得到明显提升，保护了实验动物的免疫器官。其中提前7 d运用消岩汤配合化疗疗效更好[10]。另外，与单纯化疗相比，在化疗前治疗性应用消岩汤对Lewis肺癌小鼠有明显的抗肿瘤作用，生长活动状况也较好[11]。消岩汤与化疗联合应用能够减轻晚期非小细胞肺癌的临床症状[12]，提高功能状态评分，稳定病灶，并可抑制患者血管生长因子的表达，减轻造血系统的不良反应，提高患者生活质量。消岩汤还可通过抑制肿瘤炎性微环境中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信号通路来影响非小细胞肺癌的转移，明显降低临床转移风险[13]。消岩汤联合大株红景天注射液能够明显改善患者血液高凝状态[14]。消岩汤通过减少炎症细胞因子产生，改善肺癌恶病质患者肌肉蛋白质降解，从而改善肺癌恶病质状态[15]。消岩汤可改变肺癌细胞对顺铂的敏感性，从而逆转肺癌顺铂耐药[16]。

为了研究消岩汤的基本药动学性质，并为消岩汤药效学和临床实验提供基础理论参数，本研究通过采用液质联用技术测定大鼠体内黄芪甲苷、咖啡酸不同时间点的质量浓度，研究消岩汤复方及单用君药黄芪对黄芪甲苷、咖啡酸在大鼠体内代谢的影响，从而初步探究消岩汤复方对其抗肿瘤有效成分代谢的影响。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（200±20）g，6～8周龄，由军事医学科学院动物中心提供。动物于天津中医药大学动物中心常规喂养，自由进食饮水，10 h光照/14 h黑暗，温度21～25 ℃，湿度30%～70%。动物实验遵循天津中医药大学有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

1.2 药品与试剂

普萘洛尔（批号101181527）购自上海玉博生物科技有限公司；对照品黄芪甲苷（批号110781-200613）、咖啡酸（批号110885-200102）购自中国药品食品鉴定研究所，质量分数为98.0%；乙腈（批号113911）为色谱纯，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；去离子水由Milli-Q制备；其他化学试剂均为分析纯。

1.3 药材

实验所用中药药材均由天津中医药大学第一附属医院提供，经天津中医药大学窦志英教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、太子参为石竹科植物孩儿参(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根、郁金为姜科植物温郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥块根、姜黄为姜科植物姜黄L.的干燥根茎、夏枯草为唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗、白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草(Willd.) Roxb.的全草、生牡蛎为牡蛎科动物长牡蛎Thunberg的贝壳、蜂房为胡蜂科昆虫果马蜂(DeGeer)的干燥巢。

1.4 仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），含LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测器、SIL-20A全自动进样器、LC色谱工作站；Quattro质谱仪（美国Waters公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；XK96-B型涡旋混合器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；BP211D型分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方法与结果

2.1 受试药液的制备

2.1.1 实验组ig溶液的制备 取消岩汤全方140 g，其中黄芪30 g、太子参15 g、郁金10 g、姜黄10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蛎30 g、蜂房15 g，混匀，浸泡1 h后煎煮2次，煎煮过程中每次加水量为药材量的10倍，煎煮时间为1 h，滤出药渣后合并煎液，浓缩至100 mL即质量浓度为1.4 g/mL，随后用95%乙醇醇沉，将药液调至含乙醇75%，静置24 h后滤过，药液浓缩至35 mL，即质量浓度达到黄芪生药0.85 g/mL，备用。

2.1.2 对照组ig溶液的制备 取黄芪30 g，按“2.1.1”项下方法制备，将药液浓缩至35 mL，即质量浓度达到黄芪生药0.85 g/mL，备用。

2.2 给药及样品收集

取12只Wistar大鼠，禁食不禁水12 h后随机分为对照（14.40 g/kg）组及实验（14.40 g/kg）组，每组6只。实验组ig“2.1.1”项下溶液，对照组ig“2.1.2”项下溶液，并于给药后0.17、0.33、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h，目内眦取血0.5 mL，8000 r/min离心10 min，取上清液冷冻备用。

2.3 血浆样品处理

取50 μL血浆样品，加入150 μL 内标[普萘洛尔溶于甲醇-乙腈（1∶1），配制成质量浓度为5 ng/mL的溶液]，涡旋30 s，15 000 r/min离心10 min，取上清液进样。

2.4 对照品及内标溶液的制备

2.4.1 对照品储备液的配制 分别称取黄芪甲苷、咖啡酸对照品，制成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备液。

2.4.2 内标储备液的配制 精密称取普萘洛尔对照品100.00 mg，置于100 mL量瓶中，配制成质量浓度为1.00 mg/mL的内标储备液。

2.5 测定条件

2.5.1 色谱条件 XSelect HSS T3色谱柱（75 mm×2.1 mm，2.5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～1.8 min，95% A；1.8～2.8 min，95%～20% A；2.8～4.0 min，20%～5% A；4.0～4.9 min，5% A；4.9～5.0 min，5%～95% A；5.0～8.0 min，95% A。体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.5.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI），采用多反应监测模式，在正、负离子模式下同时检测。离子源温度120 ℃；喷雾电压3.2 kV、−2.8 kV；载气为氮气；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气体积流量650 L/h；锥孔气体积流量50 L/h。具体参数见表1。

表1 质谱参数

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察 将处理后的黄芪甲苷血浆样品、咖啡酸血浆样品及普奈洛尔分别进样，得到黄芪甲苷血浆样品、咖啡酸血浆样品及普奈洛尔（内标）的MRM谱图（图1），黄芪甲苷、咖啡酸和普萘洛尔的保留时间（R）分别为3.625、2.025、2.55 min。主峰与血浆中杂质呈基线分离，且在内标和被测色谱峰周围没有杂质峰干扰，表明专属性良好。

图1 黄芪甲苷血浆样品 (A)、咖啡酸血浆样品(B)及普奈洛尔(C)的MRM谱图

2.6.2 线性关系考察 取16份空白血浆0.30 mL，其中8份加入黄芪甲苷对照品储备液和内标储备液100 μL，另8份加入咖啡酸对照品储备液和内标储备液100 μL，使黄芪甲苷终质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、80、100 ng/mL，咖啡酸终质量浓度分别为5、10、20、50、80、120、160、200 ng/mL。按“2.3”项方法处理，根据各样品MRM图谱，以血浆样品峰面积与内标峰面积的比值分别对黄芪甲苷及咖啡酸质量浓度进行线性回归。

黄芪甲苷质量浓度在1～100 ng/mL，黄芪甲苷质量浓度与黄芪甲苷峰面积和普萘洛尔峰面积的比值呈良好的线性关系，回归方程为＝0.073 439＋0.006 057，＝0.999 2。咖啡酸质量浓度在5～200 ng/mL，咖啡酸质量浓度与咖啡酸峰面积和普萘洛尔峰面积的比值呈良好的线性关系，回归方程为＝0.003 65＋0.015 86，＝0.999 6。表明黄芪甲苷及咖啡酸在相应的质量浓度范围内线性关系良好。

2.6.3 精密度及回收率考察 分别取低、中、高3个质量浓度的黄芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）进样，每个质量浓度样品在1 d内重复测定3次，连续测定3 d，计算日内、日间精密度和回收率，结果见表2，日内及日间RSD均在6%以内，回收率为88.78%～107.50%，可满足血浆样品分析要求。

2.6.4 提取回收率考察 取空白血浆样品9份，每份300 μL，高、中、低3个质量浓度分别平行操作3份，黄芪甲苷质量浓度分别为2、10、80 ng/mL，咖啡酸质量浓度分别10、50、160 ng/mL，分别加入内标工作液100 μL和高、中、低3个质量浓度的黄芪甲苷、咖啡酸对照品储备液50 μL，按“2.3”项下方法处理，以萃取后的黄芪甲苷、咖啡酸的色谱峰面积与萃取前相应质量浓度的黄芪甲苷、咖啡酸对照品储备液的色谱峰面积比值计算高、中、低3个质量浓度黄芪甲苷、咖啡酸的提取回收率见表3，RSD均＜6%。

表2 大鼠血浆样品黄芪甲苷及咖啡酸精密度和回收率(, n = 3)

2.6.5 稳定性考察

（1）室温放置稳定性：取黄芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血浆样品，在室温放置4 h后按“2.3”项处理，测定结果见表4，RSD在4.5%以内，提示黄芪甲苷、咖啡酸血浆样品在室温放置4 h内稳定。

表3 大鼠血浆样品黄芪甲苷及咖啡酸的提取回收率(, n = 3)

表4 黄芪甲苷及咖啡酸血浆样品的稳定性考察(, n = 3)

（2）冻融稳定性：取黄芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血浆样品各3份，分别冻融1次、反复冻融3次，按“2.3”项下方法处理，结果显示，RSD均在4.0%以内，提示黄芪甲苷、咖啡酸血浆样品反复冻融3次对测定结果无明显影响。

（3）血浆样品处理后低温放置稳定性：取黄芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血浆样品各3份，−4 ℃放置16 h后按“2.3”项下方法处理，结果显示，RSD在4%以内，提示经处理后的血浆样品在−4 ℃放置16 h内稳定。

2.7 药动学研究

2.7.1 黄芪甲苷房室模型及药动学参数 如表5和图2所示，实验组血药达峰浓度（max）为18.555 ng/mL，对照组max为6.169 ng/mL。实验组黄芪甲苷的消除速率常数（）、清除率（CL/F）小于对照组（＜0.05、0.01），消除半衰期（l/2β）、表观分布容积（V/F）、max、药时曲线下面积（AUC）均大于对照组（＜0.05、0.01、0.001），两组的达峰时间（max）相同。根据AIC最小、相关系数最大等指标，应用DAS 2.0程序软件对药时曲线进行分析，进行最佳房室模型拟合，实验组芪甲苷的体内过程符合二室模型，对照组黄芪甲苷的体内过程符合一室模型。

表5 黄芪甲苷药动学参数(, n = 6)

与对照组比较：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group, same as below table

图2 黄芪甲苷药时曲线(, n = 6)

2.7.2 咖啡酸房室模型及药动学参数 如表6和图3所示，实验组max为75.155 ng/mL，对照组max为18.783 ng/mL。实验组咖啡酸的CL/F小于对照组（＜0.01），l/2β、V/F、AUC、、max、大于对照组（＜0.05、0.01、0.001）。根据AIC最小、相关系数最大等指标进行最佳房室模型拟合，应用DAS 2.0程序软件对药时曲线进行分析，实验组咖啡酸的体内过程符合二室模型，对照组咖啡酸的体内过程符合一室模型。

3 讨论

液相色谱仪分离能力强，分析速度高，且分析精确度好，适用样品范围广，能回收，但难以得到物质的结构信息。质谱仪能够提供丰富的结构信息，能提供样品分子的相对分子质量信息，灵敏高，但需要纯化样品。本研究采用液质联用法，能够实现优势互补，样品处理简单，经济，合理，同时使用内标（普萘洛尔）法定量，减轻样品前处理的压力，适用于测定生物样品（大鼠血浆）中黄芪甲苷、咖啡酸的含量，灵敏度高，特异性突出，定性定量结果可靠，且快速简便，高自动化，回收率高。

表6 咖啡酸药动学参数(, n = 6)

图3 咖啡酸药时曲线(, n = 6)

药动学结果显示，给药组黄芪甲苷及咖啡酸max均高于对照组，其中实验组及对照组黄芪甲苷max同时达到，而实验组咖啡酸max小于对照组。实验组黄芪甲苷及咖啡酸血药浓度下降的速度较对照组缓慢且平稳。表明消岩汤中黄芪甲苷及咖啡酸质量浓度均高于单用君药黄芪，且ig消岩汤后黄芪甲苷及咖啡酸max均高于单药黄芪，为消岩汤药效学和临床实验提供基础理论参数。既往研究表明消岩汤有明显的抑瘤作用，本研究从宏观与微观的角度对消岩汤中有效成分黄芪甲苷、咖啡酸治疗恶性肿瘤的药效与机制进行初步研究，可见消岩汤复方配伍较单用君药能够影响其抗肿瘤成分的代谢，能够促进黄芪甲苷、咖啡酸的吸收代谢，而消岩汤中有效成分复杂，其余成分的影响有待进一步研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Pharmacokinetic study of Xiaoyan Decoction on normal rats based on HPLC-MS

NIU Xiao-yu1, 2, YANG Pei-ying1, 2, KONG Fan-ming1, 2, HAN Zeng-feng1, 2, CHA Chun-yuan1, 2, LI Xiao-jiang1, 2, JIA Ying-jie1, 2, SUN Bin-xu1, 2

1. The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China 2. National Clinical Research Center of Chinese Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China

To study the effective components in Xiaoyan Decoction (消岩汤) and analyze its metabolism in normal rats, so as to preliminarily explore the anti-tumor effective components in Xiaoyan Decoction and its metabolism law.Twelve male Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group. Rats in experimental group were ig Xiaoyan Decoction and control group was ig principal drug in Xiaoyan Decoction-Huangqi (). After administration, 0.5 mL of blood was collected from canthus at different time points. The concentrations of astragaloside IV and caffeic acid in rats at different time points were determined by LC-MS, and blood concentration-time data were obtained. The plasma pharmacokinetic parameters were calculated by DSA 2.0 software.The elimination rate constant () and clearance rate (CL/F) of astragaloside IV in experimental group were lower than those in control group (< 0.05, 0.01), and elimination half-life (l/2β), apparent distribution volume (V/F),maxand area under the drug-time curve (AUC) were higher than those in control group (< 0.05, 0.01, 0.001), peak time (max) of two groups was the same. CL/F of caffeic acid in plasma of rats in experimental group was lower than that of control group (< 0.01), whilel/2β, V/F, AUC,andmaxwere higher than those of control group (< 0.05, 0.01, 0.001).Xiaoyan Decoction can promote the absorption and metabolism of anti-tumor components astragaloside IV and caffeic acid.

Xiaoyan Decoction; pharmacokinetics; astragaloside IV; caffeic acid; liquid chromatography-mass spectrometry

R285.61

A

0253 - 2670(2022)22 - 7129 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.016

2022-05-11

国家自然科学基金资助项目（81904151）

牛小玉，硕士研究生，主要从事中西医结合肿瘤临床工作。E-mail: nxy18329700709@163.com

孙彬栩，副主任医师，主要从事中西医结合肿瘤学研究。E-mail: sunbinxu@126.com

[责任编辑 李亚楠]