干扰lncRNA DICER1-AS1通过调控miR-206抑制肺癌细胞增殖、迁移

高旦华 蒋红芳 蔡汉炯（杭州市萧山区中医院呼吸内科，杭州 311201）

近年来，肺癌的发病率呈逐年上升趋势，非小细胞肺癌是肺癌的一大种类，随着靶点及分子靶向药物的不断研发，分子靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌患者一种重要治疗手段［1-3］。研究表明lncRNA失调与肺癌在内的多种肿瘤的进展密切相关，lncRNA已被证明是潜在的生物标志物和癌症诊断和治疗的靶标［4-5］。研究报道肺癌组织中lncRNA DICER1-AS1高表达可能是促进肿瘤发生发展的重要因素［6］。lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤细胞中高表达，敲低lncRNA DICER1-AS1抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭［7］。然而lncRNA DICER1-AS1对肺癌细胞增殖、迁移的影响及机制还尚不清楚。miR-206定位于人类第6号染色体，大量研究显示miR-206的表达失调与肿瘤的进展密切相关［8］。如miR-206在肺腺癌组织中低表达，miR-206过表达可以抑制A549的迁移和侵袭［9］。miR-206通过负向调节冠蛋白1C（coronin-1C，CORO1C）抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭［10］。因此，本实验旨在研究lncRNA DICER1-AS1对肺癌细胞增殖、迁移的影响及机制是否与miR-206有关。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取杭州市萧山区中医院2018年1月至2020年1月收治的23例肺癌患者，通过手术取其癌组织及相应的癌旁组织，所有患者经病理检测确诊为肺癌，且具有完整临床病理资料，所有患者均知情同意。

1.1.2 细胞与主要试剂A549细胞（货号：CCL-185，美国ATCC）；RPMI1640培养基（货号：61870-127，美国Gibco公司）；Trizol试剂（货号：9108-1）、荧光定量试剂盒（货号：DRR420A，日本TaKaRa公司）；MTT试剂盒（货号：1000936-5，上海宾智生物科技有限公司）；Transwell小室（货号：354480，美国BD公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：D0010）、BCA试剂盒（货号：PC0050，北京索莱宝科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（货号：R40010，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组 取对数生长期A549细胞，将si-NC、si-lncRNA DICER1-AS1分别转染至A549细胞中，记为si-NC组、si-lncRNA DICER1-AS1组；将si-lncRNA DICER1-AS1分 别 与anti-miR-NC、antimiR-206共转染至A549细胞中，记为si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC组、si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206组。

1.2.2 RT-qPCR检测lncRNA DICER1-AS1和miR-206的表达水平 提取组织及细胞总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明进行PCR，PCR反应体系：2µl反转录产物、10µl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5µl，补水至20µl；反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；以GAPDH和U6为内参，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.2.3 MTT检测细胞存活率 收集各组培养48 h的细胞，按试剂盒说明操作，用酶标仪检测570 nm处吸光度（OD）值。细胞存活率（%）=实验组OD/对照组OD×100%。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 各组细胞制成细胞悬液，接种于6孔板，培养2周，分别用甲醇固定和吉姆萨染色，在低倍光学显微镜下计数＞50个细胞的集落。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移 将细胞无血清培养12 h，Transwell小室上室添加200µl细胞悬液，培养24 h后，用多聚甲醛固定和结晶紫染色，显微镜下拍照并计数迁移细胞数。

1.2.6 荧光素酶报告实验检测lncRNA DICER1-AS1和miR-206的靶向关系Starbase预测显示lnc-RNA DICER1-AS1和miR-206存在结合位点。构建lncRNA DICER1-AS1的野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-lncRNA DICER1-AS1和MUT-lncRNA DICER1-AS1，将其分别与miR-NC和miR-206共转染至A549细胞中。按照说明书检测荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot法检测Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达 提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜，封闭，加入稀释好的一抗（1∶500），4℃过夜，倒掉一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶3 000），室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL，暗室下显影、定影。检测蛋白条带灰度值，蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.3 统计学分析SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌组织及各组处理A549中的表达及其靶向关系验证 肺癌组织中lncRNA DICER1-AS1表达水平高于癌旁组织，miR-206表达水平低于癌旁组织（P＜0.05，表1）。Starbase预测显示lncRNA DICER1-AS1与miR-206存在结合位点（图1A）。miR-206与WT-lncRNA DICER1-AS1共转染的细胞荧光素酶活性显著低于miR-NC与WT-lncRNA DICER1-AS1共转染的细胞（P＜0.05，图1B）；与si-NC组相比，si-lncRNA DICER1-AS1组lncRNA DICER1-AS1表达水平降低，miR-206表达水平升高（P＜0.05），与si-lncRNA DICER1-AS1组和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC组相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206组miR-206表达水平降低（P＜0.05，图1C、D）。

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌组织中的表达（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌组织中的表达（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

Note：Compared with paracancer group，1）P＜0.05.

Groups Paracancer Lung cancer tissue tP lncRNA DICER1-AS1 1.01±0.13 3.21±0.251）37.443 0.000 miR-206 1.00±0.13 0.24±0.041）26.797 0.000

图1 lncRNA DICER1-AS1靶向调控miR-206及miR-206表达的检测Fig.1 Detection of miR-206 and miR-206 expression regulated by lncRNA DICER1-AS1

2.2 MTT法及克隆形成实验检测各组处理A549增殖的影响 与si-NC组相比，si-lncRNA DICER1-AS1组细胞存活率降低，克隆形成数减少（P＜0.05），与si-lncRNA DICER1-AS1组和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC组 相 比，si-lncRNA DICER1-AS1+antimiR-206组细胞存活率升高，克隆形成数增加（P＜0.05，图2）。

图2 各组处理A549细胞存活率及克隆形成数的检测Fig.2 Detection of survival rate and colony forming number of A549 cells in each group

2.3 Transwell检测各组处理A549迁移的影响 与si-NC组相比，si-lncRNA DICER1-AS1组迁移细胞数降低，Ki67、N-cadherin表达水平降低，E-cadherin表达水平升高（P＜0.05），与si-lncRNA DICER1-AS1组和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC组相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206组迁移细胞数增加，Ki67、N-cadherin表达水平升高，E-cadherin表达水平降低（P＜0.05，图3）。

图3 各组处理A549迁移细胞数目及Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的影响Fig.3 Number of migration cells and expressions of Ki67，N-cadherin and E-cadherin protein in A549 treated by each group

3 讨论

肺癌是当今世界上病死率和发病率都非常高的恶性肿瘤，生物靶向药物治疗、手术治疗和放疗、化疗是肺癌的重要治疗手段，且其联合治疗效果较好。研究肺癌的发生发展分子机制，寻找精准的靶点对生物靶向药物的研发具有重要意义［11-13］。研究报道lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤细胞中上调表达，lncRNA DICER1-AS1高表达与患者临床分期和远处转移显著相关，与骨肉瘤患者的临床预后不良也有关，可作为骨肉瘤的潜在预后生物标志物［14］。lncRNA DICER1-AS1在肺癌中也高表达［6］。本实验结果显示肺癌组织中lncRNA DICER1-AS1表达水平升高，与既往研究结果一致。为进一步研究lncRNA DICER1-AS1对肺癌细胞增殖、迁移的影响，本实验将lncRNA DICER1-AS1干扰表达载体转染至A549细胞中，结果显示细胞存活率降低，克隆形成数降低，迁移细胞数降低，Ki67、N-cadherin表达水平降低，E-cadherin表达水平升高。Ki67是细胞增殖核抗原，与细胞增殖相关。研究表明Ki67与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移及术后复发呈负相关，是老年肺腺癌的独立预后因素［15］。N-cadherin、E-cadherin是上皮-间质转化的相关标志物，其表达水平与肿瘤的浸润转移密切相关，研究表明下调N-cadherin和上调E-cadherin的表达可抑制肺癌细胞侵袭和转移［16］。因此，本实验表明干扰lncRNA DICER1-AS1可抑制肺癌细胞增殖和迁移。

研究表明miRNA参与肺癌的致癌性和生物学行为［17］。如上调miR-206表达可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭［18］。且研究报道lncRNA MALAT1通过靶向miR-206和AKT/mTOR信号传导可促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭［19］。lncRNA SNHG14通过miR-206/6-磷酸葡萄糖脱氢酶途径促进非小细胞肺癌的发展［20］。以上结果表明miR-206高表达可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭，且lncRNA可通过调控miR-206影响癌细胞增殖、迁移。本实验通过在线软件预测显示，lncRNA DICER1-AS1与miR-206存在结合位点，且双荧光素酶报告实验表明lncRNA DICER1-AS1靶向调控miR-206的表达。干扰lncRNA DICER1-AS1表达，miR-206表达水平升高；且抑制miR-206表达可逆转干扰lncRNA DICER1-AS1对肺癌细胞增殖、迁移的抑制作用。

综上所述，干扰lncRNA DICER1-AS1可能通过上调miR-206表达抑制肺癌细胞增殖、迁移。