lncRNA-GAS5/miRNA21 ceRNA调控网络在高氧性急性肺损伤发病过程中的作用研究①

石 磊 付 豹 何 英 廖贞亮 陈 涛 陈 淼（遵义医科大学附属医院重症医学科，遵义 563000）

高氧性急性肺损伤（hyperoxia-induced acute lung injury，HALI）是氧疗最典型的并发症，可进一步发展为成人急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）及新生儿支气管肺发育不良，是导致患者死亡及新生儿支气管发育不良的主要原因之一［1-2］。肺泡上皮细胞参与肺组织免疫调节、肺水转运、肺泡表面活性物质合成分泌、增殖、分化和修复等过程。研究表明，高氧可导致肺泡上皮细胞凋亡，促进HALI发生发展［3］。微小RNAs（miRNAs）是一组由18～25个核苷酸组成的高度保守的非编码单链RNAs，长链非编码RNA（lncRNA）是一组不具有编码蛋白质能力的功能性长链RNA，两者参与多种疾病（包括急性肺损伤）发病过程［4-5］。研究表明，miR-21在HALI进展中表达下调，且miR-21可抑制大鼠肺泡上皮细胞早期凋亡，采用慢病毒过表达miR-21能够显著改善大鼠HALI［6-7］。近年研究发现，lncRNA能够作为竞争性内源RNA（ceRNA，一个RNA可调节多个靶基因，同一个靶基因可被不同RNA调节，调控同一靶点RNA间构成竞争关系）吸附miRNAs，上调miRNA靶基因表达，发挥生物学功能。研究表明，lncRNA-GAS5能够通过负调节细胞内miR-21水平从而调控miR-21对靶基因的抑制［8-10］。因此推测HALI发病过程中miR-21水平可能受lncRNA-GAS5调节。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量约200 g，许可证号：SCXK（京）2019-0009。

1.1.2 主要试剂 慢病毒载体由北京博恒科创生物科技有限公司制备；IL-1β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒购于R&D system公司；AnnexinⅤ-PI凋亡染色试剂盒购于美国BD公司；抗大鼠GAPDH、IκBα、NF-κB p65、Lamin B1抗体均购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物干预方式SD大鼠随机分为空白组（n=6）、模型组（n=12）、lncRNA组（n=12）和lncRNA联合miRNA组（n=12），所有大鼠采用异氟烷麻醉，空白组不做任何处理，模型组静脉注射200µl慢病毒空载体（6×106TU/ml，饱和转染剂量），lncRNA组静脉注射200µl lncRNA-GAS5过表达慢病毒载体（6×106TU/ml），lncRNA联 合miRNA组 静 脉 注 射200µl lncRNA-GAS5过表达慢病毒载体（6×106TU/ml）和200µl miR-21过表达慢病毒载体（6×106TU/ml），转染72 h（饱和转染时间）后，模型组、lncRNA组和lncRNA联合miRNA组大鼠给予高氧处理，建立HALI模型：自制高氧箱（45 cm×30 cm×35 cm的有机玻璃容器，顶端开孔接氧气接头，侧面有等大出气孔，可接氧气检测仪），将SD大鼠置于高氧箱中饲养，25～27℃，50%～70%湿度，箱内氧浓度持续≥90%，箱内放置钠石灰吸收大鼠呼出的CO2，保持箱内CO2浓度＜0.5%，23.5 h/d持续给氧，上午定时开舱0.5 h添加食物、水以及更换垫料［11］。

1.2.2 呼吸指标检测 高氧处理48 h后取大鼠动脉血检测，分析氧合指数（oxygenation index，OI）和呼吸指数（respiration index，RI）。OI=PaO2/FiO2，其中PaO2为动脉氧分压，FiO2为吸入氧浓度，本研究FiO2均记为90%。RI=P（A-a）O2/PaO2，其中P（A-a）O2为肺泡-动脉血氧分压差，PaO2为动脉血氧分压。

1.2.3 肺组织病理及湿/干重比（W/D）分析 高氧处理48 h后麻醉处死各组大鼠，取大鼠右肺组织，10%甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片，进行HE染色。每只大鼠随机选取20个高倍视野（×400），采用Gustavo Matute-Bello等评分系统进行独立评分。按照肺泡及肺泡间质中性粒细胞个数、透明膜个数、蛋白碎片填充个数及肺泡间隔厚度进行评分，并取评分平均值。取大鼠左肺，快速去除周围结缔组织，滤纸擦干组织表面水分称重，记为肺湿重（W），将肺组织80℃烘烤，每日称重至恒重，记为肺干重（D），计算肺W/D。

1.2.4 血浆细胞因子水平检测 高氧处理48 h后麻醉各组大鼠，取各组大鼠外周血，离心分离血浆，ELISA检测各组大鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平，参照IL-1β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒说明书操作。

1.2.5 肺组织细胞凋亡分析 取20 mg左肺组织，0.25%胰酶+0.1%Ⅰ型胶原酶1∶1混合后注入肺组织，快速剪碎，放入摇床，150 r/min、37℃消化18 min，等体积终止液终止消化，并加入5 ml DNaseⅠ防止细胞成团，200目不锈钢滤网过滤，收集滤液，离心，弃上清，红细胞裂解液重悬沉淀，室温静置1 min，等体积2×EDTA终止，离心，弃上清，收集沉淀，即得到肺组织细胞（主要由肺泡上皮细胞和巨噬细胞组成）。AnnexinⅤ-PI凋亡染色试剂盒对分离的细胞进行染色，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.6 RT-PCR高氧处理48 h后麻醉处死各组大鼠，取大鼠右肺组织，采用Trizol法提取海马中RNA，反转录得到cDNA，RT-PCR检测海马组织细胞因子lncRNA-GAS5、miR-21、IL-1β、IL-6、TNF-α RNA表达。lncRNA-GAS5正向引物：5＇-ATTTCAAGGGCTCCTCT-3＇，反向引物：5＇-TTGGCAAATCTTCTGTTC-3＇；miR-21正向引物：5＇-TGTACCACCTTGTCGG-3＇，反向引物：5＇-TGCTGTTGCCATGAGAT-3＇；IL-1β正向引物：5＇-GATGTCGAGAGTCCCAATGA-3＇，反向引物：5＇-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3＇；IL-6正 向 引 物：5＇-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3＇，反向引物：5＇-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3＇；TNF-α正向引物：5＇-GGCTAATTCAGTTAGGCGGC-3＇，反向引物：5＇-CGGAGGACTTTGTAATGCAC-3＇；GAPDH正向引物：5＇-CGTATCGGACGCCTGGTT-3＇，反向引物：5＇-CGTGGGTAGAGTCATACTGGAAC-3＇。

1.2.7 Western blot高氧处理48 h后麻醉处死各组大鼠，取大鼠右肺组织，RIPA裂解液对组织进行裂解，Western blot检测裂解液中IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65核积累量。

1.3 统计学处理 采用GraphPad 8.0软件进行统计学分析，计量资料（xˉ±s）先进行正态检验，若服从正态分布，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析；若不服从正态分布，则选择非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HALI大鼠肺组织lncRNA-GAS5和miR-21表达RT-PCR结果显示，模型组大鼠肺组织lnc-RNA-GAS5表达显著高于空白组，而miR-21表达显著低于空白组（P＜0.01）；lncRNA组大鼠肺组织lncRNA-GAS5表达显著高于模型组和空白组，而miR-21表达显著低于模型组和空白组（P＜0.01）；lncRNA联合miRNA组大鼠肺组织lncRNA-GAS5和miR-21表达均显著高于模型组和空白组（P＜0.01，表1）。

表1 HALI大鼠肺组织lncRNA-GAS5和miR-21表 达（±s）Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats（±s）

表1 HALI大鼠肺组织lncRNA-GAS5和miR-21表 达（±s）Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA lncRNA-GAS5 1.02±0.08 2.55±0.331）12.37±2.911）2）11.72±2.871）2）miR-21 1.08±0.05 0.77±0.081）0.54±0.061）2）10.11±2.251）2）

2.2 各组大鼠呼吸指标及肺W/D相比于空白组，模型组大鼠OI显著降低，RI和W/D显著升高（P＜0.01）；相比于模型组，lncRNA组大鼠OI显著降低，RI和W/D显著升高（P＜0.01）；相比于lncRNA组，lncRNA联合miRNA组大鼠OI显著升高，RI和W/D显著降低（P＜0.05），接近模型组水平（表2）。

表2 各组大鼠呼吸指标及肺W/D（±s）Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠呼吸指标及肺W/D（±s）Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA OI/mmHg 381.91±36.77 268.83±31.681）192.46±29.591）2）255.06±31.931）3）RI 0.16±0.05 0.38±0.101）0.59±0.111）2）0.41±0.091）3）W/D 3.62±0.31 4.49±0.421）5.26±0.491）2）4.57±0.431）3）

2.3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 与空白组相比，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，lncRNA组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.01）；与lncRNA组 相 比，lncRNA联 合miRNA组 大 鼠 血 清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低（P＜0.01，表3），接近模型组水平。

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平（±s，ng/L）Tab.3 Serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αof rats in each group（±s，ng/L）

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平（±s，ng/L）Tab.3 Serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αof rats in each group（±s，ng/L）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 6.47±1.12 14.06±3.181）21.73±4.251）2）15.26±3.881）3）IL-6 22.24±7.24 47.74±10.871）69.86±14.161）2）49.02±11.621）3）TNF-α 40.70±14.33 80.60±21.851）117.73±26.381）2）82.12±25.751）3）

2.4 各组大鼠肺组织病理 与空白组相比，模型组大鼠肺间质中性粒细胞显著增多、肺泡间隔明显增厚、病理评分显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，lncRNA组大鼠肺间质中性粒细胞显著增多、肺泡间隔明显增厚及病理评分升高更为显著（P＜0.01）；与lncRNA组相比，lncRNA联合miRNA组大鼠肺间质中性粒细胞、肺泡间隔明显增厚及病理评分显著改善（P＜0.01，图1）。

图1 各组大鼠肺组织病理变化Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group

2.5 各组大鼠肺组织凋亡细胞数 流式细胞术结果显示，与空白组相比，模型组大鼠肺组织凋亡细胞数显著增多（P＜0.01）；与模型组相比，lncRNA组大鼠凋亡细胞数显著增多（P＜0.01）；与lncRNA组相比，lncRNA联合miRNA组大鼠肺组织凋亡细胞数显著减少（P＜0.01，图2）。

图2 各组大鼠肺组织细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis in lung tissue of rats in each group

2.6 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达 与空白组相比，模型组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，lncRNA组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达显著升高（P＜0.01）；与lncRNA组相比，lncRNA联合miRNA组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达显著降低（P＜0.01，表4），接近模型组水平。

表4 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group（±s）

表4 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 0.97±0.06 3.87±1.161）5.69±1.631）2）3.96±1.281）3）IL-6 1.02±0.04 6.78±1.921）11.79±2.531）2）7.01±2.311）3）TNF-α 1.04±0.08 10.03±2.671）18.61±4.061）2）10.73±3.121）3）

2.7 各组大鼠肺组织NF-κB通路激活水平Western blot结果显示，与空白组相比，模型组大鼠肺组织IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，lncRNA组大鼠肺组织IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平显著升高（P＜0.01）；与lncRNA组相比，lncRNA联合miRNA组大鼠肺组织IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平显著降低（P＜0.01，图3）。

图3 各组大鼠肺组织NF-κB通路激活水平Fig.3 Activation level of NF-κB pathway in lung tissues of rats in each group

3 讨论

miR-21是一种抗细胞凋亡基因，在细胞凋亡发生发展中起重要作用，在HALI动物模型及肺泡上皮细胞损伤模型中表达显著降低。进一步实验证明，miR-21能够通过抑制肺泡上皮细胞中PTEN蛋白表达抑制肺泡上皮细胞凋亡，改善HALI［6-7］。miR-21参与HALI发生发展，但其特定的ceRNA调节网络涉及的分子机制尚不明确。

近年lncRNA-GAS5已成为ceRNA调控基因的研究热点。研究发现，人和鼠骨骼肌分化过程中，lncRNA可竞争性结合miRNA，调控miRNA及其靶基因表达，同时也受miRNA调控［12］。lncRNA-GAS5是一种在哺乳动物细胞生长和凋亡过程中起关键调控作用的lncRNA。研究显示，乳腺肿瘤患者miR-21与lncRNA-GAS5表 达 呈 负 相 关，lncRNAGAS5是miR-21的负调节因子，可调节骨关节炎发展过程中软骨细胞存活［8-9］。本研究发现，HALI大鼠肺组织中lncRNA-GAS5表达显著升高；miR-21水平显著下降，与既往研究结果一致。提示lnc-RNAGAS5/miRNA21 ceRNA调控网络可能参与HALI发病过程。

通过慢病毒感染大鼠使大鼠体内高表达lnc-RNA-GAS5或miR-21，给予48 h持续高氧处理，观察大鼠呼吸指标及组织病理变化。OI反映肺部氧合功能，与肺损伤呈负相关；RI反映肺部气体交换功能，与肺功能呈正相关［13］。W/D反映肺泡毛细血管膜通透性变化，通透性改变是急性肺损伤病理生理学的重要参数之一。研究发现，高氧处理的大鼠出现明显急性肺损伤症状，表现为OI显著降低，RI、肺W/D、病理评分、肺组织凋亡细胞数增多，而体内过表达lncRNA-GAS5大鼠OI水平显著低于模型组大鼠，RI、肺W/D、病理评分、肺组织凋亡细胞数显著高于模型组大鼠，表明lncRNA-GAS5能够加剧急性肺损伤。进一步发现，过表达miR-21能够逆转过表达lncRNA-GAS5介导的HALI，表明lncRNA-GAS5通过抑制miR-21表达促进HALI。

炎症细胞，如中性粒细胞浸润及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的分泌是HALI发病的重要原因［14］。本研究发现，HALI模型组大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平及肺组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达相比于健康大鼠显著升高，而单独过表达lncRNA-GAS5大鼠体内IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白水平相比于模型组进一步升高，而同时过表达lncRNA-GAS5和miR-21的大鼠体内IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白水平显著低于单独过表达lncRNA-GAS5大鼠，且其水平接近模型组大鼠，提示lncRNA-GAS5/miR-21调控网络可能通过调控机体炎症反应调节肺损伤。NF-κB信号通路在炎症反应中扮演核心角色，控制转录DNA、细胞因子产生。静息状态下NF-κB与IκB结合，分布于细胞浆，机体受到刺激后，IκB发生磷酸化，磷酸化的IκB与NF-κB分离，NF-κB分子进入核内调控生物学活动［15］。NF-κB信号通路在HALI发病过程扮演重要角色［16］。本研究发现，HALI模型组大鼠肺组织IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平显著高于健康大鼠，单独过表达lncRNA-GAS5的大鼠肺组织IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平相比于模型组进一步升高，而同时过表达lncRNA-GAS5和miR-21的 大 鼠 肺 组 织IκBα磷 酸 化 及 细 胞 核 内NF-κB p65水平显著低于单独过表达lncRNA-GAS5的大鼠，且其水平接近模型组。表明lncRNA-GAS5/miR-21 ceRNA调控网络可能通过调节NF-κB信号通路激活调节HALI发生发展。

综上，lncRNA-GAS5/miR-21参与HALI发病过程，lncRNA-GAS5通过负调节miR-21表达，间接激活NF-κB通路，促发HALI。本研究明确了lncRNAGAS5/miR-21 ceRNA在HALI中的调控机制，可通过开发以lncRNA-GAS5或miR-21为靶点的药物为HALI防治提供新方法。