异钩藤碱对癫痫大鼠SIRT1/p53/caspase-3通路及海马神经元凋亡的影响

雷 琦 朱婷鸽 何进伟 赵 琳（陕西师范大学学府医院内科，西安 710119）

癫痫是一种致人衰弱的常见神经系统疾病，大脑中异常的电活动可导致自发性癫痫反复发作［1］。癫痫发作有各种病因，从遗传和先天性到神经元异常，这些异常可由缺氧、感染和炎症引起［2］。神经元凋亡在癫痫的发生发展中发挥极其重要的作用，药物干预可能成为治疗癫痫的一条新途径［3］。异钩藤碱（isorhynchophylline，IRN）为钩藤属植物的主要生物碱成分，用于治疗心血管和中枢神经系统疾病［4］。SIRT1在神经退行性疾病中发挥内源性凋亡抑制因子作用。p53可调节细胞生长和凋亡，SIRT1可通过催化p53去乙酰化调节细胞凋亡。在癫痫发生过程中通过上调SIRT1表达可降低p53乙酰化水平，减轻癫痫发作［5］。然而，关于IRN是否可通过调控SIRT1/p53/caspase-3信号通路抑制神经细胞凋亡，减轻癫痫的发作尚未见报道。因此，本研究拟通过制备癫痫大鼠模型，探究SIRT1/p53/caspase-3信号通路发挥的作用，为癫痫的预防及治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌雄SD大鼠，体质量180～200 g，购自南方医科大学，许可证号：SCXK（粤）2016-0041。实验遵循“3R”原则。

1.1.2 主要试剂与仪器IRN（纯度≥98%，S18310）、苯妥英钠（纯度≥98%，SD9350）购自北京索莱宝公司；IL-6 ELISA试剂盒（ab178013）、IL-1β ELISA试 剂 盒（ab197742）、TNF-αELISA试 剂 盒（ab181421）均购自美国Abcam公司；SIRT1一抗（8469）、Acetyl-p53一抗（2525）、cleaved caspase-3一抗（9661）购自美国Cell Signaling公司。蛋白电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自杭州Miulab公司；水迷宫分析系统购自上海欣软信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癫痫大鼠模型制备 采用氯化锂-毛果芸香碱经典方法制备癫痫大鼠模型［5］。每只大鼠在注射毛果芸香碱前18～20 h腹腔注射125 mg/kg的氯化锂。毛果芸香碱注射（25 mg/kg，腹腔注射）前30 min给予东莨菪碱预处理（1 mg/kg，腹腔注射）。大鼠癫痫发作根据Racine分级［6］，分级达到4级以上表明癫痫大鼠模型建立成功。注射毛果芸香碱90 min后，给予10%水合氯醛（3 ml/kg）终止癫痫发作。对照组大鼠注射等量生理盐水代替毛果芸香碱。

1.2.2 动物分组及处理 将制备成功的60只癫痫大鼠随机分为模型组、IRN低、中、高剂量组和苯妥英钠组，每组12只。另取12只大鼠为对照组。根据实验动物剂量换算，IRN低、中、高剂量组大鼠分别按照15、30、60 mg/kg剂量腹腔注射。苯妥英钠组按照30 mg/kg剂量腹腔注射［7］。1次/d，连续21 d。模型组和对照组腹腔注射生理盐水作为对照。

1.2.3 大鼠癫痫发作情况检测 末次给药24 h后观察大鼠癫痫发作情况，记录大鼠1 d的发作次数和持续时间，并进行Racine分级评分。

1.2.4 大鼠脑电图检测 利用生理信号采集处理系统记录各组大鼠脑电波形，分析各组大鼠脑电波的频率和波幅。

1.2.5 大鼠认知能力的检测［8］利用Morris水迷宫系统检测各组大鼠的认知能力，记录大鼠逃避潜伏期及1 min内穿越平台原位置的次数。

1.2.6 样本采集 麻醉大鼠，尾静脉取血，血清置于-80℃冰箱保存。断头取脑，在4℃下分离双侧海马组织，一侧海马组织置于4%多聚甲醛中固定，另一侧海马组织液氮速冻保存。

1.2.7 血清炎症因子含量的检测 采用ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.8 HE染色检测海马组织的病理变化 取出固定的海马组织，脱水透明，浸蜡包埋，切片，采用HE试剂盒染色，光学显微镜观察，分析各组大鼠海马组织的病理变化。

1.2.9 TUNEL法检测海马神经细胞凋亡率 利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测海马组织中神经细胞的凋亡情况。每个实验组分别随机选取5张切片，每张切片选择5个具有代表性的高倍视野（×400）。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.1 0大鼠海马组织中SIRT1、p53、caspase-3相关蛋白表达水平测定 取出冻存的海马组织，研磨加入蛋白裂解液制成匀浆，提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，加入SIRT1、p53、Acetyl-p53、caspase-3、cleaved caspase-3一抗，4℃过夜，清洗后加二抗，37℃孵育40 min。曝光显色，以β-actin为内参蛋白，使用凝胶成像系统分析蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行数据统计，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IRN对癫痫大鼠癫痫发作情况的影响 与对照组相比，模型组大鼠癫痫发作次数、持续时间及Racine评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，IRN各剂量组和苯妥英钠组大鼠癫痫发作次数、持续时间及Racine评分降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠癫痫发作情况Fig.1 Epileptic seizures of rats in each group

2.2 IRN对癫痫大鼠脑电图的影响 与对照组相比，模型组癫痫大鼠脑电频率降低（P＜0.05），波幅明显升高（P＜0.05）；经IRN和苯妥英钠处理后，明显逆转癫痫大鼠的脑电图变化（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠脑电图分析Fig.2 Electroencephalogram analysis of rats in each group

2.3 IRN对癫痫大鼠认知能力的影响 与对照组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.05），穿越平台原位置次数明显减少（P＜0.05）；经IRN和苯妥英钠处理后，明显改善癫痫大鼠的认知能力（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠认知能力比较Fig.3 Comparison of cognitive ability of rats in each group

2.4 IRN对癫痫大鼠血清中炎症因子含量的影响 与对照组相比，模型组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著增多（P＜0.05）；经IRN和苯妥英钠处理后，明显下调癫痫大鼠的炎症因子水平（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠炎症因子水平比较（pg/ml）Fig.4 Comparison of levels of inflammatory factors of rats in each group（pg/ml）

2.5 IRN对癫痫大鼠海马组织病理变化的影响对照组大鼠海马组织细胞排列整齐，细胞膜完整，核仁清晰，染色质分布均匀；模型组大鼠海马组织细胞排列紊乱稀松，体积肿大，边缘模糊，大量神经元变性坏死，胞核固缩溶解；IRN各剂量组和苯妥英钠组大鼠海马组织细胞损伤程度减轻，排列较为松散，神经元变性不明显。见图5。

图5 各组大鼠海马组织HE染色结果图（×200）Fig.5 HE staining results of hippocampus of each group of rats（×200）

2.6 IRN对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡率的影响 与对照组相比，模型组大鼠海马神经元凋亡率升高（P＜0.05）；经IRN和苯妥英钠处理后，明显减少了癫痫大鼠海马神经元凋亡（P＜0.05）。见图6。

图6 各组大鼠海马组织细胞凋亡率比较Fig.6 Comparison of apoptosis rate of hippocampus of rats in each group

图8 各组大鼠海马组织中蛋白表达水平比较Fig.8 Comparison of protein expression levels in hippocampus of rats in each group

2.7 IRN对癫痫大鼠海马组织中SIRT1、p53、caspase-3相关蛋白表达水平的影响 与对照组相比，模型组大鼠海马组织中Acetyl-p53/p53、cleaved caspase-3/caspase-3蛋白表达量增多（P＜0.05），SIRT1蛋白表达量减少（P＜0.05）；经IRN和苯妥英钠处理后，明显逆转癫痫大鼠蛋白表达水平（P＜0.05）。见图7、8。

图7 各组大鼠海马组织Western blot检测结果Fig.7 Western blot results of rat hippocampus in each group

3 讨论

癫痫是一种神经科常见病，与脑内神经元放电的异常同步性有关［9］。全世界有多达5 000万人受到影响，严重危害人类健康，然而其发病机制目前尚不明确［10］。锂广泛应用于精神病学，其潜在用途包括治疗躁狂症和老年痴呆症等。据报道，锂对人类的不良影响包括降低癫痫阈值和颞叶癫痫的沉淀［11］。因此，本研究采用氯化锂-毛果芸香碱经典方法制备癫痫大鼠模型，结果显示，造模大鼠海马组织细胞排列紊乱稀松，大量神经元变性坏死，细胞凋亡率升高，表明造模大鼠海马组织出现明显损伤。且造模后大鼠脑电波频率降低，波幅升高，认知能力减弱，提示模型构建成功。

IRN有独特的抗阿尔茨海默病活性。LI等［12］研究发现，IRN可减轻氯化铝诱导的学习和记忆障碍。本研究中在IRN的药效作用下，癫痫大鼠海马组织细胞损伤程度减轻，癫痫发作次数减少，持续时间明显缩短，脑电频率升高，波幅降低，认知和学习能力增强，提示IRN可改善癫痫大鼠的海马组织结构损伤和认知能力，减少癫痫发作。在评估IRN对小鼠认知缺陷和淀粉样蛋白病理的预防作用中发现，IRN可显著降低IL-6、IL-1β、TNF-α水平，减轻神经炎症反应［13］。本研究中，IRN处理后，大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著下调，结果与其一致，表明IRN可下调癫痫大鼠炎症因子水平。

研究发现，SIRT1/p53/caspase-3信号通路与大脑神经系统密切相关。脑缺血/再灌注大鼠模型中SIRT1过表达可减少梗死面积，降低p53蛋白乙酰化水平及caspase-3活性，减少细胞凋亡和炎症反应。在研究miR-128在癫痫中的功能和分子作用时发现，抗miR-128可能通过SIRT1/p53/Bax/细胞色素C/caspase信号通路发挥神经保护作用［14］。本研究中，Acetyl-p53、cleaved caspase-3蛋白表达升高，SIRT1蛋白表达降低，神经细胞凋亡率升高，提示SIRT1/p53/caspase-3信号通路可影响神经细胞凋亡。而IRN处理后，明显逆转了癫痫大鼠海马组织中的蛋白表达，表明IRN可能通过调节SIRT1/p53/caspase-3信号通路减轻细胞凋亡，缓解癫痫症状。

综上所述，IRN可通过SIRT1/p53/caspase-3信号通路减少海马组织神经元凋亡，抑制大鼠癫痫发作。然而，癫痫的发病机制比较复杂，IRN对于癫痫的治疗作用仍有待于进一步研究。