过表达miR-126对急性呼吸窘迫综合征模型大鼠右心功能的影响①

龙光文 张 谦 杨秀林 吉春玲 董裕康（贵州省人民医院急诊内科，贵阳 550002）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床上常见的急危重症，以顽固性低氧血症、呼吸窘迫为临床表现，肺泡毛细血管通透性增加、透明膜形成为病理生理改变的临床综合征［1］。随着对ARDS病理生理改变的再认识，右心功能在ARDS发生发展中的变化引起了关注，学者们发现ARDS患者不仅会出现肺损伤，还会出现循环损伤，导致右心功能不全以及急性肺源性心脏病的发生［2-3］。近年来报道miR-126参与多种疾病的炎症、免疫及肺脏损伤的调控，其在ARDS相关患者中低表达，高表达可以改善ARDS相关肺损伤，可作为ARDS诊断和预后的潜在生物标志物［4-6］。同时研究也显示，miR-126还具有改善心功能的作用［7-8］，但miR-126对ARDS相关心功能障碍是否有改善作用目前尚未有文献报道。本研究拟通过气道内滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制备ARDS相关右心功能障碍大鼠模型，探讨miR-126在ARDS模型大鼠心肌组织中的表达变化及过表达miR-126对模型大鼠右心功能的保护作用及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物60只SPF级雄性SD大鼠，鼠龄6～7周，体质量（220±10）g，由贵州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（黔）2018-0001。饲养环境温度22～25℃、湿度40%～70%，自由进食饮水，每日光照12 h。

1.1.2 实验试剂与仪器miR-126激动剂（agomir）及其阴性对照（agomir NC）购自广州锐博生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自上海碧云天公司；心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、肌红蛋白（Mb）、IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）和GAPDH抗体购自Proteintech公司。血气分析仪（Rapidlab 348）购自德国BD公司；多功能酶标仪（SpectraMax Paradigm）购自上海美谷分子仪器；超声诊断仪（Vivid Dimension 7）购自美国通用公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模与分组60只SD大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（Model组）、agomir阴性对照组（agomir-NC组）和miR-126 agomir组（agomir组），每组15只。其中agomir-NC组和agomir组在造模前24 h，经尾静脉注射agomir-NC或miR-126 agomir（10 nmol/只，200µl），Sham组和Model组注射等量生理盐水。采用颈部气管滴注10 mg/kg LPS建立ARDS模型［9］，以动脉血液氧合指数（OI）＜200 mmHg为造模成功标准［10］。

1.2.2 超声心动图检查评估右心功能 造模成功后24 h，采用超声心动图于大鼠胸前右心长轴上测量三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）、右心面积变化分数（FAC）、肺动脉加速时间（PAAT）和肺动脉收缩压（PASP），均测量3次后取均值。

1.2.3 动脉血氧分压（PaO2）及氧合指数（OI）测定 造模成功后24 h，分离大鼠股动脉，取股动脉血1 ml，立即进行血气分析，记录动脉血氧分压（PaO2），根据吸入气中的氧浓度分数（FiO2）计算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.2.4 HE染色观察肺及右心组织病理学变化取大鼠右肺中叶和心脏右心室，10%多聚甲醛固定24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋，制备4µm石蜡切片进行HE染色。于光镜下观察肺组织和右心组织病理学改变。

1.2.5 ELISA法检测血清中心肌损伤标志物及心肌组织中炎症因子水平 收集大鼠下腔静脉血，3 000 r/min离心15 min取血清；同时收集心肌组织，用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨制备心肌组织匀浆，充分裂解后10 000 r/min离心20 min取上清。按照ELISA试剂盒说明书操作步骤，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb以及心肌组织中IL-1β和IL-18含量。

1.2.6 qRT-PCR检测心肌组织中miR-126表达水平以及NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA水平 取适量心肌组织，采用Trizol法提取各样本总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，用逆转录试剂盒将得到的RNA合成为cDNA，然后以cDNA为模板，取10µl逆转录产物进行PCR反应，引物序列见表1。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40个循环。以U6和GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot检测心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平 取各组心肌组织100 mg，加入预冷的组织裂解液1 ml，在冰浴中超声破碎匀浆后离心取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。向SDS-PAGE通道中加入等体积蛋白质，并将蛋白质转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，PBS洗涤3次，加入一抗NLRP3、ASC、caspase-1和GAPDH（1∶1 000）一起孵育过夜。再用TBST漂洗40 min，分为3次漂洗，加入HRP标记二抗继续孵育1 h，根据ECL试剂盒说明书对蛋白条带进行显影、定影，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析，以GAPDH为内参计算各蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达miR-126对ARDS大鼠超声心动图指标的影响 如表2所示，与Sham组比较，Model组大鼠TAPSE、FAC和PAAT显著减少，PASP显著升高（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组大鼠TAPSE、FAC和PAAT显著升高，PASP显著减少（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠右心功能参数比较（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

表2 各组大鼠右心功能参数比较（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups TAPSE/mm FAC（%）PAAT/ms PASP/mmHg Sham Model Agomir-NC Agomir 3.44±0.32 2.28±0.201）2.21±0.16 3.14±0.262）57.73±5.03 32.88±2.341）33.00±1.71 52.90±3.452）32.55±3.07 22.43±1.171）21.01±1.00 29.65±1.342）28.66±1.79 64.07±3.221）65.00±2.63 35.54±1.402）

2.2 过表达miR-126对ARDS大鼠动脉血氧分压和氧合指数的影响 如表3所示，与Sham组比较，Model组大鼠动脉PaO2和OI值显著降低（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组大鼠PaO2和OI值显著增加（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠动脉PaO2和OI比较（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

表3 各组大鼠动脉PaO2和OI比较（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model agomir-NC agomir PaO2/mmHg 103.00±7.01 60.49±2.681）61.22±3.07 93.55±4.462）OI/mmHg 503.00±12.77 168.00±8.451）172.00±6.00 377.86±10.932）

2.3 过表达miR-126对ARDS大鼠心肌组织中miRNA-126表达水平的影响 如图1所示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织中miRNA-126表达水平显著降低（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组大鼠心肌组织中miRNA-126表达水平显著增加（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠心肌组织中miR-126表达水平比较Fig.1 Comparison of miR-126 expression levels in myocardial tissue of rats among groups

2.4 过表达miR-126对ARDS大鼠肺组织和右心肌组织病理学的影响 如图2所示，Sham组大鼠肺组织结构形态完整，未见明显异常；Model组和agomir-NC组大鼠肺部充血水肿、形态紊乱，肺泡间质增厚，肺不张且有透明膜形成，同时伴有大量炎症细胞浸润；agomir组大鼠肺组织结构形态明显恢复，肺泡出血减少，肺泡腔内可见少量炎症细胞浸润。Sham组大鼠右心肌组织细胞结构正常，排列整齐，未见炎症细胞浸润；Model组和agomir-NC组大鼠心肌细胞结构被破坏，排列紊乱，可见大量炎症细胞浸润；agomir组大鼠心肌细胞损伤程度减轻，细胞排列大致有序，伴有少量炎症细胞浸润。

图2 各组大鼠肺组织和心肌组织病理学观察（HE染色，×200）Fig.2 Histopathological observation of lung tissue and myocardial tissue among groups（HE staining，×200）

2.5 过表达miR-126对ARDS大鼠血清中心肌损伤标志物含量的影响 如表4所示，与Sham组比较，Model组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著增加（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量显著减少（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比较（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

表4 各组大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比较（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir cTnⅠ/（ng·ml-1）0.66±0.02 2.58±0.101）2.53±0.11 1.04±0.092）CK-MB/（U·L-1）26.50±4.61 128.46±9.501）124.33±8.60 56.66±3.062）Mb/（ng·ml-1）37.57±3.44 166.40±7.761）164.34±6.89 65.57±2.562）

2.6 过表达miR-126对ARDS大鼠心肌组织中炎症因子含量的影响 如表5所示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织中IL-1β和IL-18含量显著增加（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组大鼠心肌组织中IL-1β和IL-18含 量显著减少（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 各组大鼠心肌组织中IL-1β和IL-18含量比较（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

表5 各组大鼠心肌组织中IL-1β和IL-18含量比较（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir IL-1β/（pg·ml-1）18.83±2.56 90.65±5.501）87.64±4.00 34.99±2.932）IL-18/（pg·ml-1）36.60±2.39 119.46±6.781）115.06±5.30 65.49±2.002）

2.7 过表达miR-126对ARDS大鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1表达水平的影响 如图3所示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表达水平显著增加（P＜0.01）；与Model组比较，agomir组NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），而agomir-NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组大鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA及蛋白表达水平比较Fig.3 Comparison of mRNA and protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 of myocardial tissue among groups

3 讨论

miRNAs是一类进化上高度保守的非编码小分子RNA，早期对其研究主要集中在机体发育的调控及肿瘤形成方面，但近些年来的研究陆续发现，部分miRNAs能特异性表达于心肌细胞，参与心肌重塑、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注等心血管疾病的发生发展过程［11］。miR-126是一种内皮细胞特异性表达miRNA，存在于哺乳动物内血管丰富的组织中，调控内皮细胞的生物合成、血管发育和维持血管的完整性，是血管生成的关键调节因子，具有改善心功能的作用。成力等［12］研究发现，miR-126可能通过调控血管内皮生长因子A参与先天性心脏病相关性肺动脉高压发病；谭顺林等［13］研究指出，慢性心力衰竭患者血清miR-126水平异常表达，其可能参与了慢性心力衰竭的发生与发展；高威等［14］提出，过表达miR-126能显著抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡。但miR-126对ARDS相关心功能障碍是否有改善作用目前未知，本研究通过颈部气管滴注LPS构建ARDS大鼠模型，经尾静脉注射miR-126激动剂探讨miR-126对ARDS大鼠右心功能的保护作用及具体机制，研究结果显示，miR-126在ARDS模型大鼠心肌组织中低表达，过表达miR-126可能通过抑制NLRP3炎症小体活化来改善ARDS大鼠右心功能障碍。

本研究通过气管滴注LPS的方法建立大鼠ARDS模型，结果显示，模型大鼠动脉OI＜200 mmHg，同时HE染色结果显示大鼠肺部充血水肿、形态紊乱，有大量炎症细胞浸润，伴有肺不张、透明膜形成等ARDS的典型病理学改变，提示ARDS模型制备成功，与马绍磊等［15］研究结果相符。超声心动图是评估右心功能的良好手段，本实验的研究重点是探讨出现ARDS时心功能的变化情况，并观察过表达miR-126对ARDS时心脏功能的影响。肺动脉高压是右心功能障碍最常见的原因，PASP越高，提示肺动脉压力越高，PAAT缩短则提示肺血管阻力增加，肺动脉压力增高；TAPSE和FAC是反映右心室收缩功能的主要指标，其值降低提示右室收缩功能减退。本研究结果显示，ARDS大鼠的TAPSE、FAC和PAAT显著减小，而PASP显著增加，心肌组织HE染色结果也显示，大鼠心肌细胞增大、排列紊乱，间质有炎症细胞聚集，说明ARDS在引起肺功能损伤的同时，还会导致右心功能不全，与相关研究一致［15］。进一步通过qRT-PCR法检测各组大鼠心肌组织中miR-126的表达情况，发现模型大鼠心肌组织中miR-126表达水平明显降低，初步提示miR-126在ARDS相关心功能障碍方面可能发挥重要作用。为进一步验证其具体作用，本研究通过尾静脉注射的方式给模型大鼠注射miR-126激动剂，结果显示模型大鼠心肌组织中miR-126表达水平明显上调，动脉OI值回升，右心功能指标得到明显改善，同时心肌组织和肺组织病理性改变明显减轻，提示过表达miR-126可改善ARDS大鼠心功能。

NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是机体固有免疫应答的重要组成部分，通常情况下机体NLRP3活性处于抑制状态，当NLRP3受外界刺激被激活时，活化的效应蛋白caspase-1可促进IL-1β和IL-18的成熟与释放，造成组织损伤并加剧炎性疾病的发展。心肌组织的炎症反应是导致右心功能障碍的主要原因之一，这可能是右心功能障碍的基础［16］。cTnⅠ、CK-MB和Mb为心肌损伤特异性标志物，当心肌细胞受损时其在血液中的含量会异常升高［17］。为进一步探究miR-126改善ARDS大鼠心功能的作用机制，本研究对大鼠心肌组织中NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达水平、炎症因子以及心肌损伤标志物含量进行检测，研究结果显示，模型大鼠心肌组织中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA和蛋白表达水平以及IL-1β、IL-18、cTnⅠ、CK-MB和Mb含量均显著增加，过表达miR-126可显著降低以上指标在心肌组织中的含量，提示miR-126可能通过抑制NLRP3炎症小体活化，抑制炎症因子释放，从而减轻ARDS大鼠心肌损伤，发挥其心功能保护作用。

综上所述，本研究从超声心动图、心肌组织病理学改变、蛋白分子水平及心肌组织炎症指标等不同层面，证实过表达miR-126可通过抑制NLRP3炎症小体活化、减轻炎症反应对ARDS相关右心功能障碍发挥保护作用。