圣草酚对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的改善作用及机制探讨①

杨舒钧 梁红亮 滕 俊 魏 娜 谢 锐（三六三医院消化内科，成都 610041）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是以肠道炎症性细胞浸润、肠黏膜受损为主要表现的病变，疾病发展后期会波及大段肠腔，引发中毒性结肠炎、肠外并发症，甚至结肠癌，严重威胁人们的生命［1-2］。目前，对于UC的治疗药物主要以糖皮质激素、生物制剂及免疫抑制剂为主，具有一定的疗效，但其毒副作用不容忽视。研究显示天然有效成分对治疗UC效果明显、副作用小，如芍药苷、原花青素、白藜芦醇等。因此，寻找安全有效的天然药物对治疗UC具有重要意义。

圣草酚又名北美圣草素（eriodictyol），是一种天然的类黄酮化合物，广泛存在于药用植物、水果蔬菜中，具有良好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性［3-4］。BAI等［5］的报道指出，圣草酚可抑制高糖诱导的细胞外基质积累、氧化应激和人类肾小球系膜细胞的炎症。王茹等［6］研究显示，圣草酚对小鼠结肠炎可以起到缓解作用，可能与激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化、抗炎作用有关。但圣草酚对UC的具体作用机制仍不清楚，因此，本研究拟建立葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的大鼠UC模型，探讨圣草酚对DSS诱导的大鼠UC损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1.1 实验动物50只雄性SPF级Wistar大鼠，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。动物实验遵循我国《实验动物福利伦理审查指南（GB/T 35892-2018）》原则与要求。

1.1.2 药物与试剂DSS购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；诱导型一氧化氮合酶试剂盒（iNOS）、TNF-α试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-10试剂盒购自上海纪宁实业有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；苏木素-伊红染色（HE）试剂购自北京雷根生物技术有限公司；TUNEL凋亡试剂盒购自美国R&D Systems公司；Bax、Bcl-2、p65等相关抗体购自上海艾博抗有限公司。

1.1.3 主要仪器DNM-9602酶标分析仪，DG3090自动洗板机购自上海精密仪器仪表有限公司；TGL16M高速冷冻离心机购自湖南凯达科学仪器有限公司；BD-SW3002生物显微镜购自深圳博视达光学仪器有限公司；Biosafer-20TA纯水仪购自南京赛飞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 将50只雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后，随机分为5组：健康对照组、模型组（DSS）及3个不同浓度剂量组（DSS+圣草酚10、20、40 mg/kg）。除健康对照组饮用纯净水外，其余各组大鼠饮用4%DSS溶液7 d，继续饮用纯净水3 d后，3个剂量组给予相应浓度药物，而健康对照组与模型组给予相同剂量的羧甲基纤维素钠（CMC-Na），1次/d，连续灌胃10 d。末次给药后，采用10%水合氯醛进行麻醉，用采血针腹主动脉取血，离心后取上清液待测；取各组大鼠肛门2 cm以上的全部结肠，将结肠肠管纵行剖开，取部分结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，剩余结肠用生理盐水处理，制备10%的结肠匀浆，置于-80℃冰箱保存，待测。

1.2.2 疾病活动指数评分（DAI）在实验期间，每日称大鼠体质量、观察大鼠粪便性状、检测大鼠粪便隐血情况，并记录结果，参照文献［7］根据表1评分标准进行疾病指数统计，计算公式：DAI=（体质量下降指数+粪便性状+粪便隐血）/3。

表1 疾病活动指数评分标准Tab.1 Disease activity index scoring criteria

1.2.3 评估结肠黏膜损伤指数（CMDI）剖取大鼠肛门至盲肠末端的结肠段，清理肠系膜及粘连组织，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗干净，平铺于滤纸上，参照文献［8］按表2进行结肠黏膜损伤程度评分。

妇产科急腹症常见于宫外孕、黄体破裂以及卵巢囊肿蒂扭转等。具体的诊断要结合其病史以及尿妊娠试验进行鉴别。

表2 结肠膜损伤评分标准Tab.2 Colonic membrane injury score criteria

1.2.4 HE染色观察病理形态 取蜡块包埋的结肠组织，组织切片机切片。经水浴展平、置载玻片烘干、二甲苯脱蜡后，进行HE染色，封片后在显微镜下观察。

1.2.5 结肠组织病理学评分（HS）石蜡切片常规HE染色后光学显微镜下观察评分。参照文献［9］按照表3进行结肠组织病理学评分。

表3 结肠组织病理学评分标准Tab.3 Colon histopathology score criteria

1.2.6 ELISA检测炎症因子的含量 取1.2.1制备的血清，分别按照iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-10试剂盒说明书操作，用酶标仪进行检测。

1.2.7 Western blot检测炎症因子相关蛋白的表达 取1.2.1制备的结肠匀浆液，加入RIPA裂解液，冰浴30 min后，离心取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，煮沸使蛋白变性，获得上样样本。采用SDS-PAGE分离蛋白并转膜，进行脱脂奶粉封闭后，分别加入iNOS、IL-10相关一抗，在4℃下孵育过夜，TBST冲洗，加入二抗孵育1 h，TBST冲洗3次，ECL显影后分析灰度值，实验重复3次。

1.2.8 TUNEL观察结肠组织凋亡情况 根据TUNEL试剂盒说明进行相应操作，在光学显微镜下观察结肠组织凋亡细胞并拍摄。

1.2.9 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达 采用Bax、Bcl-2、Caspase 3等相关一抗，根据1.2.7的操作进行。

1.2.10 试剂盒检测氧化应激标志物水平 采用SOD、MDA、LDH、GSH试剂盒，按照相关说明书进行操作。

1.2.11 Western blot检测结肠组织中AKT/NF-κB通路的相关蛋白表达 采用AKT、P65等相关一抗，根据1.2.7进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行数据分析，多组数据用单因素方差分析（One-Way ANOVA），计量资料用±s表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 圣草酚对DSS诱导的大鼠结肠炎损伤程度的影响 健康对照组大鼠无体质量降低、粪便松软、便血等症状，毛发光亮，状态良好；结肠黏膜无粘连、溃疡等症状；大鼠黏膜上皮完整，表面光滑，细胞形态正常，排列整齐，黏膜下层、肌层、浆膜层结构清晰，未见炎症细胞浸润。模型组大鼠精神萎靡、活动量和进食量减少，体质量增长缓慢甚至减轻，大便松散，逐渐出现腹泻、便血的症状；大鼠结肠与周围组织有不同程度粘连，肠腔扩张，纵行剖开多见溃疡；大鼠黏膜上皮坏死脱落，大面积溃疡形成，腺上皮细胞增生，黏膜层、黏膜下层充血水肿，大量的炎症细胞浸润。

除DSS+圣草酚10 mg/kg组状态与模型组相似外，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组大鼠结肠无粘连及肠腔扩张，纵行剖开后少见溃疡，局部充血，黏膜下层轻度充血水肿，见少量炎症细胞浸润，未见明显溃疡（图1A），状态均优于模型组，有不同程度的改善。统计DAI、结肠黏膜CMDI、结肠组织HS。结果显示，与健康对照组相比，模型组DAI、CMDI、HS评分明显升高；与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组无显著性差异，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组DAI、CMDI、HS评分均明显降低，且具有一定的剂量依赖性（图1B～D）。

图1 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC损伤程度的影响Fig.1 Effect of eriodictyol on damage degree of DSSinduced UC rats

2.2 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC炎症因子水平的影响ELISA检测结果显示：与健康对照组相比，模型组促炎因子iNOS、TNF-α、IL-1β含量明显升高，抗炎因子IL-10含量明显降低；与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组差异无统计学意义，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组iNOS、TNF-α、IL-1β含量均明显降低，IL-10含量明显升高，且具有一定的剂量依赖性（图2）。

图2 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC炎症因子水平的影响Fig.2 Effect of eriodictyol on levels of inflammatory factors in DSS-induced UC rats

2.3 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC凋亡水平的影响TUNEL检测结果显示：细胞核中有棕黄色着染者为凋亡细胞，被染上棕色的细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变，肝细胞变小、变圆、核固缩；而正常细胞的胞核不着染。健康对照组大鼠结肠组织中凋亡细胞数目极少，细胞排列整齐；模型组大鼠凋亡细胞明显增加，而模型组阳性细胞在肝小叶内多为散在分布，也有成簇分布，凋亡细胞呈圆形或椭圆形，呈现棕褐色阳性染色。与模型组相比，各给药组大鼠的凋亡状态有不同程度的减轻。数据统计显示，与健康对照组相比，模型组的凋亡率明显升高；与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组差异无统计学意义，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组的凋亡率明显降低（图3A）。

Western blot检测结果显示：与健康对照组相比，模型组Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3的表达量明显升高；与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组差异无统计学意义，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3的表达量明显降低，且具有一定的剂量依赖性（图3B）。TUNEL与Western blot的检测结果相符。

图3 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC凋亡水平的影响Fig.3 Effect of eriodictyol on apoptosis level of DSSinduced UC rats

2.4 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC氧化应激标志物水平的影响 与健康对照组相比，模型组MDA、GSH、LDH含量明显升高，抗氧化酶SOD活性明显降低；但与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组差异无统计学意义，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组MDA、GSH、LDH含量明显降低，SOD活性明显升高，且具有一定的剂量依赖性（图4）。

2.5 圣草酚对DSS诱导的大鼠UC AKT/NF-κB磷酸化的影响 与健康对照组相比，模型组p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表达量明显上调；与模型组相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg组差异无统计学意义，DSS+圣草酚20、40 mg/kg组p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表达量明显下调，且具有一定的剂量依赖性（图5）。

3 讨论

UC临床表现为持续腹痛、腹泻、黏液脓血便，病情反复，患者备受折磨。目前的治疗药物在临床使用上有一定的局限性。中药具有多层次、多角度、多靶点等优势，因此，从传统中药或天然成分出发，寻找安全有效的方法具有重要意义。此前有研究证明，圣草酚具有良好的抗炎活性，对关节炎、免疫性脑脊髓炎等疾病具有良好的改善作用，但未见圣草酚对UC的影响［10-11］。因此，本研究探讨圣草酚对DSS诱导的大鼠UC的作用及机制。

目前，评估DAI、CMDI等反映UC的严重程度。此外，细胞因子的产生及表达与UC密切相关，是炎症反应的重要指标，包括IL、IFN、TNF-α家族等。其中，抑制TNF-α通常作为临床上治疗炎症性肠病的标准，IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子异常产生，会导致肠道上皮细胞大量死亡［12］。ZHANG等［13］的报道指出，HLJ2作为UC的潜在治疗药物，有效降低大鼠体质量减轻、结肠挛缩、DAI、CMDI、HI，降低炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的产生；ZHU等［14］的研究显示，小檗碱通过抑制IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，上调IL-4和IL-10的表达，发挥抗炎效应，缓解UC的炎症程度。本研究显示，用DSS诱导的大鼠UC模型出现体质量减轻、腹泻、血便等现象，观察显示结肠粘连，大面积溃疡，炎症细胞浸润，与人体UC组织病理学变化相一致，而给予圣草酚的各组病理状况得到改善，DAI、CMDI、HS评分也明显降低。此外，圣草酚抑制促炎因子合成，促进抗炎因子释放，与上述研究一致。提示圣草酚能够缓解DSS诱导的大鼠UC组织损伤程度，改善炎症水平及免疫紊乱。

研究表明，在UC发病过程中，肠道细胞凋亡速率增加，分化中的结肠细胞大量死亡，未成熟隐窝细胞的过度增殖，严重破坏肠道屏障，致使炎症、溃疡、肠道功能紊乱的发生。其中Bax基因促进细胞凋亡，而Bcl-2基因抑制细胞凋亡，两者通常以二聚体的形式发挥作用，Bax/Bcl-2决定细胞凋亡的发展进程［15］。此外，Caspase蛋白家族在细胞凋亡过程中也发挥着重要作用，其激活与过表达可能直接导致细胞凋亡，其中Caspase3处于凋亡有序级联反应的下游，是细胞凋亡的执行者，当细胞接受凋亡刺激时，被系列反应激活，进而诱导细胞发生凋亡［16］。本研究采用TUNEL与Western blot两种方法检测凋亡情况，结果显示圣草酚通过减少细胞凋亡率，降低Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表达，改善DSS诱导的大鼠UC程度。

氧化应激是UC的发病机制之一［17］。其中，丙二醛（MDA）是自由基发生过氧化反应的产物［18］，可通过检测MDA来判断结肠黏膜氧自由基的水平及脂质过氧化反应的强度、组织损伤程度；乳酸脱氢酶（LDH）是生物体内糖酵解途径中至关重要的氧化还原酶，当细胞损伤时，LDH上升，细胞膜通透性增高，故LDH水平可作为肠上皮细胞的损伤监测指标；超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化金属酶，当SOD含量降低时，氧自由基清楚能力降低可组织细胞损伤。此外，NF-κB是调节免疫的关键。WANG等［19］的报道指出，圣草酚通过抑制小鼠炎症性COX-2/NLRP3/NF-κB途径改善脂多糖诱导的急性肺损伤；AMIRSHAHROKHI等［20］研究显示，非布索坦可通过抑制小鼠中的NF-κB、促炎症细胞因子和氧化应激来缓解UC。本研究显示圣草酚能够减少MDA、GSH、LDH水平，提高SOD活性，下调p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表达。提示，圣草酚能够提高大鼠抗氧化能力，改善组织过氧化程度，降低DSS诱导的大鼠UC氧化应激反应，通过下调AKT/NF-κB通路相关蛋白磷酸化表达，缓解DSS诱导的大鼠UC程度。

综上所述，圣草酚能够有效缓解DSS诱导的大鼠UC损伤程度，其机制可能与下调AKT/NF-κB通路相关蛋白的磷酸化表达，改善炎症水平，减少细胞凋亡，提高大鼠抗氧化能力，缓解氧化应激反应等有关。