番石榴叶多糖超声波细胞粉碎辅助提取工艺及其体外抗氧化活性

孙颖，李宗泽，徐晋，孙京格，白雨禾，贺晓阳，韩冉，石磊

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

植物碳水化合物的范围很广，包括单糖、双糖、低聚糖以及多糖。十多个、数百个或数千个单糖通过糖苷键连接组成的生物大分子通常称为植物多糖[1]。近年来，相关研究表明植物多糖具有多种生物活性，并且能够很好地与抗氧化剂、抗炎剂相互作用，从而具有促进细胞活力、免疫调节和抗肿瘤等功能[2]，因此被认为是一种对人类健康有益的天然抗氧化剂[3]。

一般来说，植物多糖是在细胞内产生和积累的，因此必须使细胞壁破裂才能进行多糖的提取[2]。超声辅助提取法是基于超声波在液体中空化作用的一种物理破碎过程，其具有耗能低、耗时短、操作简单和不引入化学试剂等优点。研究表明，槟榔多糖通过超声辅助提取，多糖提取率可提升至6.10%[4]。相关研究一般使用超声波清洗机作为辅助提取设备，其空化力量较为分散，更适用于脱气和清洗。本文选取超声波细胞破碎（ultrasonic cell crushing，UCC）法进行细胞破壁，其优势是使全部能量集中于探头，可以在较低能量和较短时间内将具有高细胞壁硬度的细胞中的多糖进行溶解和释放[5]。

番石榴叶为番石榴（Psidium guajava Linn.）的干燥叶及其带叶嫩枝的统称，其多分布于我国南方。现代药理研究表明番石榴叶含有多种活性物质，如黄酮类、多酚类、多糖类等[6]。已有研究表明番石榴叶多糖（guava leaf polysaccharide，GLP）能够抑制 α-葡萄糖苷酶活性，有效地降低餐后血糖水平[7]。目前，相关研究主要集中在番石榴叶中的黄酮类和酚类化合物的提取和活性分析，对GLP的提取和活性的研究甚少[8]。本文采用UCC辅助提取GLP，利用Box-Behnken试验设计优化提取条件，探究一种更高效、节能、省时的提取方法，并对优化提取后的GLP体外抗氧化活性进行评价。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

番石榴叶：广西省玉林市；苯酚、三氯乙酸（均为分析纯）：上海吉至生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海麦克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；三氯化铁（分析纯）：天津索罗门生物科技有限公司；铁氰化钾（纯度98%，分析纯）：南京草木源生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波细胞粉碎机（JY92-ⅡN）：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平（BSA124S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；立式冷藏柜（SC-242D）：青岛海尔特种电冰柜有限公司；鼓风干燥箱（DZF-6050）：上海一恒科学仪器有限公司；摇摆式粉碎机（HK-04B）：广州市旭朗机械设备公司；高速冷冻离心机（J-25）：美国BECKMAN公司；全波长酶标仪（MULTISKANGO）：美国Thermo公司；实验室pH计（Delta320）：瑞士梅特勒-托利多公司；超净台（HF-safe900）：上海力申科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLP的前处理

将番石榴叶于65℃真空干燥箱烘干（2 h～3 h）至恒重，磨碎过80目筛，密封保存。对番石榴叶进行基本成分测定：水分含量测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》；灰分含量测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；粗脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中粗脂肪的测定》[9]。

1.3.2 GLP提取工艺流程

GLP的提取采用UCC辅助水提醇沉进行提取。精确称量番石榴叶粉末2.00 g，按照一定的料液比加入蒸馏水搅拌均匀，超声波细胞破碎8 min，热水浸提，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入9倍体积无水乙醇搅拌均匀，4℃冰箱静置12 h，3 000 r/min离心10 min弃去上清液收集沉淀，60℃烘干，加蒸馏水复溶定容到25 mL，采用苯酚-硫酸法测定GLP含量。

1.3.3 番石榴叶多糖含量测定和得率计算

采用苯酚-硫酸法[10]测定GLP含量：移取待测多糖溶液100 μL置于试管中，依次加入100 μL苯酚溶液（6%）、500 μL 硫酸迅速混匀，沸水浴 20 min，冷却至室温，采用酶标仪测定490 nm处OD值。测定不同浓度梯度葡萄糖标准溶液在490 nm处的OD值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为y=0.001 9x+0.004 2，R2=0.999。结合标准曲线计算多糖得率，公式如下。

式中：C为根据葡萄糖标准曲线计算得到的多糖浓度，μg/mL；V为多糖溶液的体积，mL；N为稀释倍数；m为番石榴叶粉末质量，μg。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 料液比对GLP得率的影响

称量2.00 g番石榴叶粉末，以料液比为变量，进行单因素试验。固定提取温度60℃，提取时间20 min，超声功率 120 W，考察料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对 GLP 得率的影响。

1.3.4.2 提取温度对GLP得率的影响

称量2.00 g番石榴叶粉末，以提取温度为变量，进行单因素试验。固定料液比1∶15（g/mL），提取时间20 min，超声功率 120 W，考察提取温度 60、70、80、90、100℃对GLP得率的影响。

1.3.4.3 提取时间对GLP得率的影响

称量2.00g番石榴叶粉末，以提取时间为变量，进行单因素试验。固定料液比1∶15（g/mL），提取温度 80℃，超声功率 120 W，考察提取时间 10、15、20、25、30 min 对GLP得率的影响。

1.3.4.4 超声功率对GLP得率的影响

称量2.00g番石榴叶粉末，以超声功率为变量，进行单因素试验。固定料液比1∶15（g/mL），提取温度80℃，提取时间 15 min，考察超声功率 60、120、180、240、300 W对GLP得率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

以单因素试验结果为基础，根据Box-Benhnken中心组合设计三因素三水平的响应面试验，研究各个变量以及各个变量的交互作用对GLP得率的影响，得出UCC辅助提取GLP的最优工艺条件。

1.3.6 抗氧化试验

1.3.6.1 ·OH清除能力测定

采用Fenton反应体系法[3，11]测定·OH清除能力：试管中加入多糖溶液0.1 mL，再依次加入0.1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，0.1 mL 6 mmol/L的过氧化氢溶液，1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，37℃水浴1 h，在510 nm处测定OD值记为A1。用蒸馏水代替样品溶液测定OD值记为A0，用蒸馏水代替H2O2溶液测定OD值记为A2，按照公式（1）计算·OH清除率。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力测定

试管中加入多糖溶液0.2 mL，接着加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），涡旋仪混匀，暗处放置30 min，517 nm处测定OD值记为A1。用无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，测定OD值记为A2，并测定0.2 mL DPPH-乙醇溶液和0.2 mL无水乙醇混合液的OD值记为A0[3]。以无水乙醇为参比，以VC作为对照，DPPH自由基清除率按公式（2）计算。

1.3.6.3 总还原力测定

样品总还原力的测定采用普鲁士蓝法[12]，具体操作参照杨露等[13]的方法：准确吸取0.10 mL多糖溶液置于试管中，依次加入0.25 mL磷酸盐缓冲溶液（pH6.6，0.2 mol/L）和0.25 mL 1%铁氰化钾溶液，50℃水浴20 min，然后加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应。3 000 r/min离心10 min，取上清液0.25 mL，加0.25 mL无水乙醇和0.05 mL 0.1%FeCl3溶液，涡旋仪振荡，700 nm处测定OD值，平行测定3次，以VC作为对照。OD值越大说明多糖的总还原力越强。

1.3.6.4 O2-·的清除能力测定

参照邻苯三酚自氧化法[11]并稍作修改。取pH8.2的0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液0.3mL，加入样品0.1mL，在25℃下恒温20 min后，加入同样25℃预温的25 mmol/L邻苯三酚0.04 mL，混匀后准确反应4 min，用0.05 mL的浓HCl终止反应，作为试验组A1。以蒸馏水代替样品，作为空白组A0。以同样预温为25℃的蒸馏水0.04mL代替邻苯三酚溶液作为对照组A2。每组进行3组平行试验，8 000 r/min，4℃，离心 3 min，325 nm 处测OD值。按公式（3）计算O2-·的清除率。

1.4 数据分析

每组试验重复3次，结果采用平均值±标准差表示；使用Excel 2010软件对数据进行统计分析并绘制图表，使用Design-Expert 12进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 番石榴叶基本成分

番石榴叶基本成分测定结果如表1所示。

表1 番石榴叶基本组分分析Table 1 Basic components of guava leaves%

表1结果显示番石榴叶中主要成分为碳水化合物。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对GLP得率的影响

料液比对GLP得率的影响结果如图1所示。

图1 料液比对GLP得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of guava leaf polysaccharide

由图1可知，随着溶剂用量的增加，GLP的得率先增加后减少，在料液比1∶15（g/mL）处得到最大值，GLP得率为（1.05±0.03）%。料液比为 1∶10（g/mL）的条件下，溶液浓度较高，溶质不能均匀分散在溶剂中，导致GLP得率较低；随着溶剂用量的增加，多糖浓度较低，醇沉不完全从而影响GLP得率。因此，选择料液比1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）进行后续试验。

2.2.2 提取温度对GLP得率的影响

提取温度对GLP得率的影响结果如图2所示。

图2 提取温度对GLP得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of guava leaf polysaccharide

如图2所示，随着提取温度的升高，GLP的得率先增加后减少，在80℃处达到最大值，GLP得率为（0.89±0.05）%。在60℃～80℃时，GLP得率增加的主要原因是随着提取温度不断升高，溶液黏度逐渐减小，传质速率越来越快，与此同时细胞破坏严重，番石榴叶细胞壁结构发生改变，变得疏松多孔，多糖更易溶出[7]；提取温度超过80℃后，高温破坏了多糖的结构，导致GLP得率降低。提取温度对GLP得率影响相对较小，因此固定提取温度为80℃。

2.2.3 提取时间对GLP得率的影响

提取时间对GLP得率的影响结果如图3所示。

图3 提取时间对GLP得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of guava leaf polysaccharide

如图3所示，随着提取时间的延长，GLP的得率先增加后减小，在15 min时达到最大值，GLP得率为（0.92±0.05）%。在 10 min～15 min时，随着提取时间的延长，多糖逐步从细胞内溶出，GLP得率增加；随着提取时间继续延长，多糖分子中的五碳环或六碳环可能裂解成为可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或单糖，造成多糖在醇沉过程中溶解损失增加[12]。因此，选择提取时间10、15、20 min 进行后续试验。

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2.2.4 超声功率对GLP得率的影响

超声功率对GLP得率的影响结果如图4所示。

图4 超声功率对GLP得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of guava leaf polysaccharide

如图4所示，随着超声功率的增加，GLP得率先增大后减小，在120 W时达到最大值，GLP得率为（0.96±0.03）%。这可能是由于超声波产生的空化作用，加速破坏植物细胞壁，从而促进了传质；但过高的超声功率会导致多糖水解[6，13]，从而使GLP得率降低。因此，选择超声功率60、120、180 W进行后续试验。

2.3 响应面试验

2.3.1 模型方程的建立与显著性检验

以单因素试验结果为基础，选择料液比、提取时间和超声功率这3个因素进行响应面试验，通过Box-Benhnken法进行三因素三水平的响应面设计。因素和水平见表2，响应面试验结果见表3。

表2 响应面试验因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface test

表3 响应面试验结果Table 3 Results of response surface test

通过Design-Expert 12软件对表3的数据进行分析，拟合得到料液比、超声功率和提取时间对GLP得率的二元多次回归方程：Y=1.98-0.291 1A+0.134 9B+0.143 1C-0.003 3AB+0.052 6AC+0.141 4BC-0.540 7A2-0.221 7B2-0.507 8C2。

方差分析结果见表4。

表4 回归方程的显著性和方差分析Table 4 Significance and variance analysis of regression equation

由表4可知，响应面回归方程的模型是极显著的，失拟项不显著，说明模型的拟合性良好。A项、B项和C项P＜0.01，说明3个因素对GLP得率的影响均极显著；BC项P＜0.05，说明超声功率和提取时间的交互作用对GLP得率影响显著；A2项、B2项和C2项P＜0.01，说明A2项、B2项和C2项对GLP得率影响极显著。预测系数（R2=0.986 9）与调整系数（R2Adj=0.969 9）基本一致，说明本试验拟合的模型与实际符合度高，误差小，较易实现。F值大小体现了单个因素对GLP得率影响的大小，因此由F值可知，各因素对GLP得率的影响大小顺序：A（料液比）＞C（提取时间）＞B（超声功率）。

超声功率与提取时间交互作用的响应面和等高线图见图5。

图5 超声功率与提取时间交互作用对GLP得率的影响Fig.5 Effect of interaction between ultrasonic power and extraction time on the yield of guava leaf polysaccharide

从图5可以看出，超声功率与提取时间交互作用的等高线图呈现椭圆形，响应面图坡度较为陡峭，说明超声功率与提取时间的交互作用对GLP得率的影响显著，与方差分析结果一致[14]。

通过响应面模型分析得知，GLP最优提取工艺条件为料液比 1∶13.690（g/mL）、超声功率 141.717 W、提取时间15.889 min。考虑到实际操作情况，对提取工艺参数进行调整，最终的提取工艺条件：料液比1∶14（g/mL）、超声功率140 W、提取时间16 min，经验证试验，得到GLP得率为（2.00±0.08）%，与预测值[（1.99±0.06）%]相对误差仅0.50%。

2.4 GLP体外抗氧化活性

2.4.1 ·OH清除能力

GLP和VC对·OH的清除率结果如图6所示。

图6 GLP和VC的·OH清除率Fig.6·OH scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

如图6所示，浓度为0.1 mg/mL～0.6 mg/mL时，GLP对·OH的清除率呈剂量依赖性升高，其中在0.5mg/mL～0.6 mg/mL时急剧升高。浓度为0.6 mg/mL时VC的·OH清除率为31.7%，GLP的·OH清除率为23.3%，说明GLP对·OH有很强的清除能力。经计算，GLP对·OH清除能力的IC50值为12.155 mg/mL。

2.4.2 DPPH自由基清除能力

GLP和VC对DPPH自由基清除能力结果如图7所示。

图7 GLP和VC的DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH·scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

如图7所示，样品浓度为0.1 mg/mL～0.6 mg/mL时，随着样品浓度的升高，VC和GLP对DPPH自由基的清除率不断地升高，GLP对DPPH自由基清除能力与VC相似，但是略低于VC。浓度为0.6 mg/mL时，VC的DPPH自由基清除率为75.96%，GLP为65.43%。GLP对DPPH自由基有较强的清除能力。经计算，GLP对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.261 mg/mL。

2.4.3 总还原力

GLP和VC的总还原力能力如图8所示。

图8 GLP和VC的总还原力Fig.8 Total reduction capacities of guava leaf polysaccharide and VC

如图8所示，样品浓度为0.2 mg/mL～1.2 mg/mL时，VC和GLP的总还原力随样品浓度的升高而增大，但是GLP的还原力明显低于VC。随着样品浓度增加，VC和GLP总还原力的差值也随之加大。结果表明，GLP具有良好的总还原能力，与罗游[7]的研究结果一致。

2.4.4 O2-·清除能力

GLP和VC对的O2-·清除能力如图9所示。

图9 GLP 和 VC的 O2－·清除率Fig.9 O2-·scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

线粒体电子传递系统会产生O2-·，是一种初始弱自由基。与此同时，O2-·可能产生其他强自由基进而导致各种疾病的发生[15-16]。如图11所示，样品浓度为0.01 mg/mL～0.06 mg/mL 时，GLP 对 O2-·的清除率随着浓度的升高而增大，总体呈现剂量依赖性升高。经计算，GLP对O2-·清除能力的IC50值为0.660 mg/mL。

3 结论

本文通过单因素试验和响应面试验优化GLP提取工艺，得到最优工艺条件为料液比1∶14（g/mL），超声功率140 W，提取时间16 min，此条件下，番石榴叶多糖得率可达（2.00±0.08）%。通过体外抗氧化试验研究了最优工艺提取的GLP的抗氧化活性。结果表明，0.6 mg/mL GLP对·OH 的清除率为（23.30±1.29）%，对DPPH自由基的清除率为（65.43±2.56）%；0.06 mg/mL GLP 对 O2-·的清除率为（22.30±1.53）%，并且具有较强的总还原力，随着GLP浓度的升高，总还原力也随之增强。本研究结果为番石榴叶多糖作为天然抗氧化剂的应用提供了参考依据。