高速剪切协同热处理对豌豆蛋白性质的影响

潘月影，许娜娜，苏梦香，季慧*

（1.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000；2.青岛市粮油质量检测和军队供应中心，山东 青岛 266071）

豌豆又叫寒豆、雪豆，在我国中部及东北部地区有大量种植，其产量在豆类农作物中排名第四，食用性仅次于大豆。除了食用，国内对豌豆的深加工主要是从中提取淀粉，用于制作粉丝，加工过程中的副产物豌豆蛋白在豌豆中含量很高，约占豌豆干重的23.3%～31.7%[1]，其作为一种植物源蛋白具有低脂、低热量、低致敏性和高营养价值[2]等特点。豌豆蛋白氨基酸组成比较平衡，是赖氨酸等必需氨基酸的良好来源，生物价为48%～64%，功效比为0.6～1.2，高于大豆蛋白[3]。豌豆蛋白因其突出的特点，近年来成为食品行业的焦点。然而豌豆蛋白的功能性质较差，加热过程中易变性，溶解性降低[4]，限制了其在食品行业的应用，因此寻求一种安全可靠的方法来提高豌豆蛋白的溶解性，是增加其蛋白资源附加值和扩大豌豆产业链的关键。

为了提高蛋白的溶解性，国内外学者研究了一系列的蛋白改性方法，最常见的是物理方法、化学方法和酶法，包括超声处理[5]、动态高压微流化[6]、微粉化[7]、热处理[8]、酶解[9]等。物理改性方法是价格低廉型、环境友好型、安全无毒型的蛋白质处理方法，在蛋白质加工中被广泛应用。化学改性可能会产生有毒的副产物；酶法改性作用条件温和，专一性强，不会破坏蛋白质原有的功能性质，实用性强。

目前，对豌豆蛋白的研究主要集中于不同的热处理[10]、高压[11]、超声和pH值[12]等对其功能性质的影响，然而运用高速剪切和热处理相结合的方法来改善豌豆蛋白功能性质的研究较少。高速剪切和热处理属于物理改性的范畴，具有安全、无毒性、环保等特点，是一种绿色改性技术；并且与传统的磁力搅拌处理相比，高速剪切的物理力更强，有利于蛋白溶解。本研究采用高速剪切和热处理相结合的方法处理豌豆蛋白溶液，通过研究该处理方法对豌豆蛋白溶解性的影响，探究最佳处理条件，以期改善豌豆蛋白的功能特性，进而提高使用价值，拓宽应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆蛋白粉（≥99%）：山东塔林食品有限公司；血清白蛋白（≥98%）：合肥千盛生物科技有限公司；磷酸（≥85%）：天津市致远化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250、石蜡油、十二烷基硫酸钠、无水乙醇、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

数显高速剪切分散乳化机（AD300S-H）：上海昂尼仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计（L6S）：上海仪电分析仪器有限公司；高速离心机（TG16G）：河南北弘实业有限公司；磁力搅拌加热锅（SY-DF3-2A）：上海尚仪仪器设备有限公司；真空冷冻干燥机（FD-1-50）：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

分别配制1%和14%的豌豆蛋白悬浮液于锥形瓶中，放入冰箱中过夜，充分水合备用。之后进行高速剪切和热处理，取部分处理后的样品真空冷冻干燥后测定性质。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 高速剪切转速对豌豆蛋白溶解性的影响

水合过夜后，取出豌豆蛋白溶液，用磁力搅拌加热锅搅拌至温度为25℃，分别进行转速为0、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 r/min，时间为 2.5 min 的高速剪切处理，剪切结束后，测定溶解性。

1.3.2.2 高速剪切时间对豌豆蛋白溶解性的影响

方法同1.3.2.1，控制高速剪切过程中温度为25℃，转速为 7 000 r/min，时间分别为 0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min，测定溶解性。

1.3.2.3 热处理温度对豌豆蛋白溶解性的影响

方法同1.3.2.1，控制高速剪切转速为7 000 r/min，时间为 2 min，热处理温度分别为 25、60、70、80、90、100℃，测定溶解性。

1.3.3 正交试验

根据单因素试验确定高速剪切转速、时间、温度各因素的最佳范围，在此基础上进行正交试验，因素水平见表1（D为空白列，在方差分析中作为误差列），每份样品平行制备3份，计算平均溶解性，确定高速剪切协同热处理最佳工艺并探究其对豌豆蛋白功能性质的影响。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.4 豌豆蛋白功能性质的测定方法

1.3.4.1 溶解性的测定

采用考马斯亮蓝法[13]测定豌豆蛋白的溶解性，以每升水溶液中溶解豌豆蛋白的毫克数来表示豌豆蛋白的溶解性。

1.3.4.2 持水性的测定

分别取各豌豆蛋白冻干粉1 g（W1）加入到已知质量的离心管（W2）中，再加入20 mL去离子水，搅动溶液，振荡离心管，使其充分溶解，之后在30℃的恒温水浴锅中放置30 min，再在3 000 r/min的转速下离心15 min，倾去上清液，称量总质量（W3）。计算豌豆蛋白的持水性。

1.3.4.3 持油性的测定

分别取各豌豆蛋白冻干粉1g（W1）加入到已知质量的离心管（W2）中，再加入20mL石蜡油，搅动溶液，振荡离心管，使其充分溶解，之后在30℃恒温水浴锅中放置30min，最后在3000r/min的转速下离心15min，倾去多余的油液，称量总质量（W3）。计算豌豆蛋白的持油性。

1.3.4.4 乳化性的测定

根据Guo等[14]的方法稍作调整，经热处理后的豌豆蛋白溶液，在4 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液15 mL，加入5 mL石蜡油，用高速剪切机处理混合溶液1 min，设定高速剪切的转速为10 000 r/min，制得乳液，在液体均匀时，立刻从底部吸取0.05 mL的乳液，加到5 mL质量分数为0.1%的十二烷基硫酸钠溶液中混合搅拌均匀，在波长为500 nm处测定该液体的吸光度，记为A0。之后按照下式计算豌豆蛋白的乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI），用来描述蛋白的乳化性能。

式中：N为稀释倍数；θ为油体积分数，%；C为溶液浓度，g/mL；A0为起始吸光度。

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，采用SPSS统计分析软件（Version 25.0）进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05认为有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 高速剪切转速对豌豆蛋白溶解性的影响结果

高速剪切转速对豌豆蛋白溶解性的影响见图1。

如图1所示，固定处理温度25℃，高速剪切时间2.5 min，随着高速剪切转速的逐渐增大，豌豆蛋白的溶解性先增加后减小，当转速为6 000 r/min时，溶解性最大，为76.59 mg/L，与未处理相比增加了22.11%。可能是因为剪切力破坏了蛋白间的氢键、疏水相互作用和静电相互作用，使蛋白质聚集体的尺寸减小，表面积增加，从而使蛋白与水的作用面积增大，溶解性增加[15]。并且剪切转速越大，对蛋白的破坏程度越大，蛋白尺寸越小，故在一定的范围内，随着转速的增大，溶解性增加。但当转速增大到一定程度时，溶解性呈现下降趋势，可能是因为高强度的机械能转化成了热能，从而使蛋白质发生部分变性，变性后聚集[16]。因此，在正交试验中，剪切转速选用5 000、6 000 r/min和7 000 r/min。

2.1.2 高速剪切时间对豌豆蛋白溶解性的影响结果

高速剪切时间对豌豆蛋白溶解性的影响见图2。

由图2所示，固定高速剪切转速7 000 r/min，处理温度25℃，随着剪切时间的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后减小，当剪切时间为2.0 min时，溶解性最大，为80.63 mg/L，与未处理相比增加了28.56%。溶解性增加可能是因为剪切力使蛋白质的表面结构打开[17]，蛋白比表面积增大，活性位点增加[18]，蛋白与水相互作用的概率增加。随后，溶解性呈下降趋势，可能是因为长时间的剪切作用使机械能转化成了热能，从而使蛋白质发生部分变性，变性后聚集[19]。因此，在正交试验中，剪切时间选用1.5、2.0 min和2.5 min。

2.1.3 热处理温度对豌豆蛋白溶解性的影响结果

热处理温度对豌豆蛋白溶解性的影响见图3。

由图3可知，固定高速剪切转速7 000 r/min，时间2.0 min，随着热处理温度的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后减小，当热处理温度为80℃时，溶解性最大，为88.98 mg/L，与未经热处理（25℃）相比增加了10.36%。当热处理温度低于80℃时，随着温度的升高，溶解性增加，可能是因为维持蛋白质高级结构的作用力疏水相互作用是吸热反应，升高温度会增强疏水相互作用，从而使疏水基团之间能更好地缔合，藏于溶质分子内部，极性基团暴露于溶质表面[20]；也可能是因为巯基转化成二硫键[21]，二硫键的生成迫使肽链不同地方的氨基酸残基聚集在一起，迅速折叠形成稳定的空间结构，其中疏水性氨基酸残基会分布在二硫键附近[22]，从而更多的疏水基团被锁定在分子内部。

但随着处理温度再升高，豌豆蛋白获得更高的能量，使其能够破坏维持蛋白质高级结构的氢键、范德华力、静电力和疏水相互作用等，改变蛋白质的构象，使蛋白质变性。一般在55℃蛋白质开始变性[23]，但蛋白质的变性不一定导致溶解性下降[24]。当处理温度高于80℃时，蛋白质变性严重，结构展开，从而使包埋于蛋白质分子内部的疏水基团暴露，故溶解性下降[15]。此外，溶解性下降还可能是因为，温度升高会加剧蛋白质分子的热运动，促使蛋白质颗粒发生相互碰撞的概率增大，从而导致蛋白质聚集[10]。因此，在正交试验中，热处理温度选用70、80℃和90℃。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果

正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表2极差分析结果可知，影响豌豆蛋白溶解性大小的因素顺序为A（剪切转速）＞B（剪切时间）＞C（热处理温度）。由表3可知，因素A（剪切转速）和B（剪切时间）对豌豆蛋白溶解性的影响具有显著性（P＜0.05），是影响豌豆蛋白溶解性的主要因素，因素C（热处理温度）对豌豆蛋白溶解性的影响较小。由以上结果分析得出最佳剪切工艺条件为A3B2C2，即剪切转速7 000 r/min，剪切时间2.0 min，热处理温度80℃。

2.2.2 验证试验

高速剪切协同热处理对豌豆蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性的影响见图4。

由图4可知，剪切转速为7 000 r/min，剪切时间为2.0 min，热处理温度为80℃时，豌豆蛋白的溶解性为88.98 mg/L，其比正交试验中的任何一次实验的溶解性都大，表明该处理条件可作为豌豆蛋白的最佳改性条件。并且与未处理的豌豆蛋白相比，经过该处理后的蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性分别增加了41.87%、56.82%、12.50%和13.17%。豌豆蛋白持水性增加可能是因为温度升高，分子的布朗运动增加，水分子在蛋白中分布更均匀，蛋白更易吸水。持油性和乳化性增加可能是因为高速剪切使蛋白结构展开，原来藏在分子内部的疏水性基团暴露，蛋白更易包裹油滴。

3 结论

高速剪切和不同热处理对豌豆蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性均有一定的影响，综合分析得出最佳处理条件：高速剪切转速7 000 r/min，时间2.0 min，热处理温度80℃，此条件下，豌豆蛋白的溶解性达到最大，持水性、持油性和乳化性也有一定程度的增加。综上，通过对豌豆蛋白进行高速剪切和热处理，其功能性质得到改善，这为豌豆蛋白在食品中的应用提供了参考，可以推动豌豆蛋白的进一步开发和利用，提高蛋白资源的利用率。