低温等离子体对金鲳鱼蛋白质和脂质氧化的影响

符婉丽，桑晓涵，陈姑，刘宸成，岑南香，王佳媚

（海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228）

金鲳鱼（Trachinotus ovatus），又名卵形鲳鯵、黄腊鲳，属鲈形目鯵科鲳鯵属，暖水性中上层鱼类，主要分布于印度洋、太平洋、大西洋热带、亚热带和温带海域[1]，富含油酸、棕榈酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亚油酸等重要不饱和脂肪酸类，占脂肪酸总量的64%[2-3]。金鲳鱼鱼肉中氨基酸含量丰富，远高于其他鱼类，其中含有人体必需氨基酸7种，是一种营养价值高、口感细嫩、味道鲜美的海产食品原料[3]。2020年，我国金鲳鱼产量约为16万t～17万t，产业价值巨大，其中，内销量约占40%，出口量约占60%，内销产品以鲜鱼、冰鲜鱼和冷冻鱼为主，出口产品以整条冻鱼为主[4]。近年来，国内外市场对新鲜产品的需求量稳步上升，如何有效保持金鲳鱼新鲜度是研究的重点。

等离子体是指在高电压的作用下，不同气体分子被部分或者完全电离分解成离子、电子、中性粒子、自由基、基态和激发态分子以及紫外光子等物质的集合，被认为是第四态物质[5]。低温等离子体的生成过程非常复杂，主要形成带电粒子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等活性成分[6]。近几年，低温等离子体在食品应用方面已有相关研究。低温等离子体可以有效减缓冰鲜鱿鱼的酶解程度，降低有机大分子结构改变的速率，增强冰鲜鱿鱼的保水性[7]，能杀死生鲜草鱼表面的微生物和避免鱼肉中的组胺含量超标，延长鱼肉货架期并保证鱼肉品质[8]。等离子体活化冰能有效抑制贮藏期东方对虾微生物的生长速度，对γ－变形菌纲弧菌目生长抑制效果较为明显[9]。等离子体活化水冰能有效抑制三文鱼片表面单增李斯特菌的生长繁殖，显著减缓三文鱼片pH值和挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值的升高，提高三文鱼片新鲜程度[10]。但是，Vandamme等[11]研究发现低温等离子体产生的氧化物可以促进油酸氧化，会增加油脂含量高的食品脂质氧化的风险。

本文采用不同条件低温等离子体对金鲳鱼进行处理，研究低温等离子体对金鲳鱼中蛋白质和脂质氧化的影响，为低温等离子体在金鲳鱼保鲜包装方面提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜金鲳鱼（个体质量约1 500 g～2 000 g）：市售。

总蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所；溴酚蓝溶液、磷酸盐缓冲溶液、三氯乙酸、硫代巴比妥酸：国药集团化学试剂有限公司；盐酸溶液、十二烷基硫酸钠、盐酸胍、2，4－二硝基苯肼、2－二硝基苯甲酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、尿素、无水乙醇、乙酸乙酯：西陇科学股份公司；氯化钠：广东广试试剂科技有限公司。所有试剂均为优级纯。

1.2 仪器与设备

BK130/36高压电转换器：美国PHENIX公司；PL303电子分析天平：梅特勒－托利多仪器有限公司；722G紫外可见光光度计：北京普析通用仪器有限公司；制冰机：中外合资广州柯尼塔电器有限公司；IW-86L338超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司；TGL-16MS型台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；H-360气调包装机：苏州森瑞保鲜技术有限公司；XC07-II型无菌拍打式均质器：南京宁凯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将新鲜金鲳鱼和冰块一起包装运回实验室，洗净，去头、去皮、去尾。依照背鳍的位置，将鱼分成两部分，去骨，用蒸馏水将鱼肉表面的污渍清理干净，并用厨房纸吸附鱼肉表面的水分。将鱼肉均匀分切，再称取适量鱼肉放入塑料包装盒中，密封，进行低温等离子体处理。

1.3.2 样品处理条件

1.3.2.1 处理时间

样品采用空气包装，以直接处理方式，在70kV分别处理 0、1、2、3、4、5min，处理后立即打开包装，取样测定。

1.3.2.2 处理电压

样品采用空气包装，以直接处理方式，分别在40、50、60、70、80 kV 处理 3 min，处理后立即打开包装，取样测定。

1.3.2.3 处理次数

样品采用空气包装，以直接处理方式，在70 kV处理 3 min，处理时间 3 min 平均分成 1、2、3、4 次，每次间隔30 s。处理后立即打开包装，取样测定。

1.3.2.4 处理后放置时间

样品采用空气包装，以直接处理的方式，在70 kV处理3 min，分别在处理后立即打开包装和4℃放置24 h打开包装，取样测定。

1.3.2.5 处理方式

样品采用空气包装，分别以直接和间接处理方式，在70 kV处理3 min，处理后立即打开包装和在4℃放置24 h，取样测定。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 肌原纤维蛋白提取

取5 g（精确到0.01 g）鱼肉样品于25 mL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L）中。用均质机均质，10 000 r/min均质5次，每次10 s。完成后放入离心机，10 000 r/min离心10 min。倒掉上清液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀3次，后加入20 mL磷酸盐缓冲溶液（0.6 mol/L氯化钠，磷酸盐缓冲溶液），同样条件下均质1次，完成后放入冰箱提取18 h。18 h后将样品放入离心机，10 000 r/min离心10 min。取上清液作为肌原纤维蛋白溶液测定。

1.3.3.2 羰基含量测定

参照陈晓楠等[12]的方法，并稍作修改。将肌原纤维蛋白原液稀释至2 mg/mL，在2 mL离心管内加入0.5 mL肌原纤维蛋白稀释液和0.5 mL 2，4－二硝基苯肼（10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼，2 mol/L 盐酸），对照组也加入0.5 mL肌原纤维蛋白稀释液和0.5 mL 2 mol/L盐酸溶液（不含2，4－二硝基苯肼），室温下反应1 h。再加入0.5 mL质量分数为20%的三氯乙酸溶液，在12 000 r/min条件下离心10 min（4℃），倒掉上清液，加入1 mL无水乙醇乙酸乙酯混合应用液，同样条件下重复离心操作4次，至沉淀无颜色。将沉淀物溶于1.5 mL 6 mol/L盐酸胍溶液中，在37℃下准确水浴15 min，在12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，盐酸胍溶液进行调零。在370 nm处测吸光值后进行羰基含量计算。

式中：A为370 nm波长处的吸光值；n为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数22 000，L/（mol·cm）；ρ为蛋白质质量浓度，mg/mL。

1.3.3.3 总巯基含量测定

按照徐红艳等[13]的方法进行测定。将肌原纤维蛋白原液稀释至2 mg/mL，取0.5 mL肌原纤维蛋白稀释液，加入2 mL尿素－十二烷基硫酸钠溶液（8.0 mol/L尿素，30.0 g/L十二烷基硫酸钠，0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，pH值为7.4）和0.5 mL 10 mmol/L 2－二硝基苯甲酸试剂（0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，pH值为7.4）。用磷酸盐缓冲溶液代替肌原纤维蛋白稀释液做对照组。室温下反应15 min，取上清液在412 nm下测定吸光值。

式中：A为412 nm波长处的吸光值；n为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数11 400，L/（mol·cm）；ρ为蛋白质质量浓度，mg/mL。

1.3.3.4 表面疏水性测定

根据张晗等[14]的方法进行测定。用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mmol/L）将肌原纤维蛋白原液稀释至2 mg/mL。取1 mL肌原纤维蛋白稀释液，加入1 mg/mL的溴酚蓝溶液200 μL。用磷酸盐缓冲溶液代替肌原纤维蛋白稀释液做对照组。混合均匀，25℃下反应10 min，后3 000 r/min离心15 min，将上清液稀释10倍，在595 nm波长处测吸光值。以磷酸盐缓冲液作为空白，溴酚蓝结合量按下式计算。

式中：A1为空白对照组溴酚蓝吸光值；A2为样品吸光值。

1.3.3.5 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值测定

依据GB 5009.181—2016《食品安全国家标准食品中丙二醛》[15]中的方法进行测定，并稍作改良。取鱼肉样品2 g（精确到0.01 g），加入10 mL三氯乙酸混合液，均质，加盖密封后置于恒温振荡器内50℃振摇30 min。取出，冷却至室温，双层滤纸过滤。弃去初滤液，续滤液备用。移取滤液5 mL于试管内，加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，另取5 mL三氯乙酸混合液加5 mL硫代巴比妥酸水溶液作为样品空白，加塞混匀。沸水浴中反应30 min，冷却。以样品空白调节零点，于532 nm处测定样品溶液的吸光值。

1.4 数据分析

试验数据采用4次重复试验结果的平均值，用DPS数据处理系统软件进行单因素方差分析，Duncan新复极差法进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，Origin 2020软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白羰基含量的影响

低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白羰基含量的影响如图1所示。

金鲳鱼蛋白质羰基含量随低温等离子体处理时间的延长而整体上显著上升（P<0.05），处理5 min时羰基含量为4.28 nmol/mg。处理电压越高，金鲳鱼蛋白质羰基含量也越高，当电压增高到80 kV时，羰基含量为1.60 nmol/mg。低温等离子体处理过程中产生大量具有氧化作用的活性粒子，氧化氨基酸残基侧链，尤其是侧链上有NH—或NH2基团的氨基酸，生成羰基化合物，导致蛋白质氧化变性。升高处理电压，不仅能破坏蛋白质的一级结构，增加肌原纤维蛋白中游离氨基酸含量[16]，还能有效提高低温等离子体放电功率，增加高能粒子密度[17]，使自由基和活性成分含量增加，从而提高蛋白质氧化效率。总处理时间（180 s）固定不变，随着处理次数增加，鱼肉羰基含量显著下降（P<0.05）。低温等离子体处理次数增加即处理时间缩短，短时处理产生的活性成分如活性氮和活性氧很难被激发或产生的量很少[18]，导致蛋白质氧化程度减弱。处理后放置24 h的鱼肉羰基含量略高于处理后放置0 h。因低温等离子体中大部分活性物质寿命很短，且穿透度浅[19]，长时间贮藏影响效果不明显。直接处理的样品羰基含量显著高于间接处理组（P<0.05）。直接处理中样品直接暴露于低温等离子区域中，处理产生的活性成分可直接与相关基团发生反应，导致蛋白质氧化程度加剧。

2.2 不同低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白总巯基含量的影响

低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白总巯基含量的影响如图2所示。

总巯基含量与蛋白质氧化程度呈负相关，是评定蛋白质氧化程度的一个重要指标。肌原纤维蛋白中含有大量巯基，当蛋白质发生氧化时，内部巯基就会形成二硫键[20]。总巯基含量随低温等离子体处理时间延长而显著下降（P＜0.05）。低温等离子体激发过程中会产生ROS等活性物质，且ROS攻击的重要位点是半胱氨酸的巯基[21]，促使二硫键生成，导致总巯基含量降低。随处理时间延长产生的活性物质增多，导致半胱氨酸的巯基基团损失加剧，氧化程度升高。金鲳鱼蛋白质总巯基含量随处理电压升高呈下降趋势，当电压低于60 kV总巯基含量显著性下降（P＜0.05），高于60 kV时变化不显著。当处理电压高于60kV时，气体之间的相互碰撞就会加剧，使得电离状态不稳定，各类粒子进一步聚合或是部分反应消耗[22]，对鱼肉蛋白质的攻击作用减弱。鱼肉蛋白质总巯基含量随处理次数增多而缓慢上升，总处理时间（180 s）不变，处理次数增加，易导致活性氧含量偏低。海春旭等[23]发现，低剂量活性氧不能彻底破坏细胞的生理平衡，甚至能促进细胞内相关反应进行，起到一定的抗氧化作用。处理后放置0 h的总巯基含量高于处理后放置24h（P＜0.05），肌原纤维蛋白发生氧化，其内部巯基就会被暴露形成二硫键，且氧化过程不可逆。因处理后放置时间增加，导致蛋白质氧化时间延长，氧化程度加深。间接处理的总巯基含量略高于直接处理，说明直接处理能促进金鲳鱼蛋白质氧化。

2.3 不同低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白表面疏水性的影响

低温等离子体处理条件对金鲳鱼蛋白表面疏水性的影响如图3所示。

蛋白质构象发生变化时，埋藏于分子内部的疏水性氨基酸残基会暴露于分子表面，导致蛋白质表面疏水性增加，即表面疏水性与蛋白质氧化程度成正比。因溴酚蓝具有结合疏水性基团的能力，通常用溴酚蓝结合量表示表面疏水性。溴酚蓝结合量随处理时间延长呈上升趋势，处理时间2 min～4 min，活性成分含量快速积累，蛋白质结构变松散，溴酚蓝结合量快速增加。处理电压增加，溴酚蓝结合量整体上显著上升（P＜0.05）。当总处理时间（180 s）恒定，溴酚蓝结合量随低温等离子体处理次数增加呈下降趋势；处理次数超过2次时，鱼肉中的肌原纤维蛋白和脂质氧化程度减弱。总处理时间不变，处理次数增多，导致活性成分和自由基与鱼肉蛋白质和脂质反应时间缩短，尽管激发次数增多，表面疏水性也未表现差异性。延长处理后放置时间和改变处理方式都能显著影响鱼肉的表面疏水性。Luo等[16]指出肌原纤维蛋白结合水能力的强弱与α－螺旋结构含量有关，低温等离子体处理促使α－螺旋结构含量降低，减弱肌原纤维蛋白结合水能力。

2.4 不同低温等离子体处理条件对金鲳鱼TBARS值的影响

低温等离子体处理时间对金鲳鱼TBARS值含量的影响如图4所示。

硫代巴比妥酸值（TBARS值）表示脂质氧化生成丙二醛的含量[24]，用于评价脂质初级氧化产物进一步氧化成二级产物的程度。处理时间越长，金鲳鱼肉的TBARS值越高；增加处理电压，TBARS值也随之增加。Rød等[25]发现，低温等离子体处理电压、处理时间增加，猪肉中脂质氧化程度也会增加。随处理时间延长，处理电压升高，等离子体形成的氧化活性粒子增多，鱼肉中的不饱和脂肪酸被氧化分解，导致TBARS值升高。当处理总时间固定3 min，处理次数由1变为2时，金鲳鱼肉的TBARS值显著下降（P<0.05），当处理次数继续增加至4，鱼肉的TBARS值缓慢下降。处理次数越多，低温等离子体对鱼肉脂质氧化作用越小。处理后放置24 h，样品的TBARS值升高不显著。放置时间对鱼肉中脂质氧化影响不显著，这与前面对蛋白质的影响效果相一致。直接处理组金鲳鱼肉的TBARS值略高于间接处理组。尽管间接处理时，鱼肉样品和电极之间存在较远距离，但是对鱼肉脂质氧化的影响不明显。因此，影响低温等离子体处理后金鲳鱼的脂质和蛋白质氧化的主要因素为处理电压、处理时间和处理次数，而处理后放置时间和间接处理方式对鱼肉氧化的影响作用不显著。

3 结论

升高处理电压和延长处理时间，都能增强金鲳鱼肉的脂质和蛋白质氧化；当总处理时间（180 s）不变，增加处理次数，能够降低脂质和蛋白质氧化程度；延长处理后放置时间和间接处理方式，鱼肉中氧化指标未发生显著变化。低温等离子体处理能够加快金鲳鱼中蛋白质和脂质氧化反应，不同处理条件因素对其氧化程度影响较高，因此，采用低温等离子体处理时，应严格控制处理条件，将蛋白质和脂质氧化程度控制在可接受范围内，保证鱼肉品质为消费者所接受。