冠状动脉微血管内皮细胞功能障碍分子机制的研究进展

吴小雷

皖南医学院第二附属医院心血管内科，芜湖 241000

近年来随着冠状动脉微血管疾病的发生、发展，现已逐渐受到多数医学工作者们的关注。2017年我国有关共识将冠状动脉微血管疾病定义为受多种相关致病因素的影响下，机体冠状小动脉以及小动脉功能或结构异常而导致的心肌缺血或心绞痛等具有客观证据的综合征［1］。近年来亦有相关研究发现，临床症状表现为胸痛，但通过冠脉造影结果显示为正常的健康体检者中，冠状动脉微血管疾病患者的发病率高达60%左右，且在该类患者中心肌梗死、心肌缺血以及心绞痛等相关心血事件的发生率明显升高，推测冠状动脉微血管疾病的发生可能是导致该类患者预后不良的重要因素［2］。此外，冠状动脉微血管疾病的致病因素较为复杂，且波及的人群较为广泛，临床亦缺乏规范且科学的检测手段，进而给冠心病的系统管理及防治工作带来了巨大挑战［3］。因此，进一步加深对该病的认知就显得尤为重要。此外，导致冠状动脉微血管疾病发生的相关危险因素与冠状动脉粥样硬化相似，包括高游离脂肪酸、高血压、衰老以及糖尿病等，而这些因素均以损害机体血管内皮细胞结构和机体血管内皮细胞功能为病理特征。相关研究发现，冠状动脉微血管细胞约占心脏内细胞总量的1/3，同时在维持冠状动脉微血管正常运转期间发挥重要作用，且冠状动脉微血管细胞功能发生异常时，其正常情况下均先损伤心肌［4］。冠状动脉微血管内皮细胞（CMEC）功能障碍主要是指在相关病理作用下，CMEC的增殖、迁移、粘附、凋亡以及分泌等功能受损，进而导致CMEC功能发生障碍，导致冠状动脉微血管收缩，心肌供血异常等，同时亦是CMEC功能异常的早期表现，现阶段关于CMEC功能障碍的相关机制虽然尚未阐明，本研究现就CMEC功能障碍的分子机制展开综述。

线粒体活性氧自由基（ROS）的积累

细胞在机体中的正常生长以及代谢期间均可产生ROS，但通过在多种相关机制的作用下亦可使氧化还原状态持续保持平衡［5］。在高血压或糖尿病患者中，由于机体中的高血压、高胰岛素、高血糖对血管内皮刺激，进而导致机体内皮细胞的应激水平上升，因此，高血压、高胰岛素、高血糖亦被认为是导致该类患者CMEC功能发生障碍的主要因素。当机体血压升高期间亦可导致血管紧张素表达水平上升，激活蛋白激酶C（PKC）所依赖的烟酰胺脱氢酶，进而诱导机体超氧阴离子表达水平上升。此外，在炎症因子、高血脂以及高血糖等因素影响下，机体血管内皮细胞促氧化酶活性增强，促使ROS表达水平提高。同时ROS大量累积亦会导致一氧化氮信号通路受到影响，降低一氧化氮信号通路生物利用度，进而促使微血管内皮功能发生障碍。除上述直接参与的氧化还原相关蛋白外，亦有学者发现还存在其他相关蛋白参与了ROS相关的信号通路，进而引起CMEC积累，激活叉头框蛋白1（FoxO3A），FoxO3A激活后不仅能够降低ROS表达水平，同时亦能有效抑制B细胞淋巴瘤因子2xL（Bcl2-xL），最后一刻触发CMEC凋亡［6］。Bax抑制剂1通过抑制黄瞟吟氧化酶/F-肌动蛋白信号通路，进而调节线粒体融合，减轻机体因缺血在灌注而导致的CMEC损伤。此外，在复氧/缺氧的模型中，CMEC/ROS信号通路激活早期生长反应因子1（Egr-1）转至下游基因，进而导致CMEC损伤。综上，ROS在CMEC损伤的机制不仅复杂且涉及多个层次，原因可能与机体细胞所处的环境、ROS表达水平等相关。当ROS水平处于相对较低的情况下，线粒体内参与氧化还原平衡的抗氧化相关蛋白，当ROS表达水平上升至一定程度后促使氧化还原失衡，ROS可能更多作为信号传导分子用以去激活信号通路以及蛋白进而引起生物学反应。现阶段有关下游通路虽然较为复杂，但能够确定是机体细胞所处的应激背景（高糖、脂肪酸炎症以及缺氧等）对ROS细胞及其介导的信号有一定影响。

一氧化氮合酶（NOS）信号通路失调

NO是机体血管功能重要的稳态调控因子，其主要是由L-精氨酸化合物在NOS的催化下进行形成［7］。现阶段，已知在人体血管内皮细胞中存在2种NOS，包括损伤后出现的损伤后诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）以及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）。eNOS属于钙离子（Ca2+）依赖的一种酶，而iNOS是非Ca2+依赖并受内毒素以及细胞因子调控，且eNOS在催化水平较低的NO（nmol级）时，对血管稳态发挥着重要的调节作用，而iNOS在催化水较高的NO（μmol级）时其参与了机体多种病理的发展过程。内皮细胞受氧化应激刺激后，内皮细胞中Ca2+释放，Ca2+与钙调素相结合进而形成的复合物进而激活eNOS，eNOS在血红素、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及黄素单核苷酸（FMN）等辅助因子的调控下，进而导致NO半衰期缩短，使其加快释放同时进入血液并与血红素结合，从而激活鸟苷酸环化酶（cGMP），使其水平增高，受蛋白激活酶的激活后亦可维持血管稳态、调节血管舒张。此外，亦有研究发现eNOS活性以及eNOS信号受阻是多种血管疾病发生的核心特征，现阶段尼可地尔是首选治疗因CMEC功能障碍诱发心绞痛的药物，通过活化静脉血管平滑肌促使cGMP上升，进而发挥血管扩张，改善血管供血作用［8］。影响NOS辅助因子活性以及相关底物亦可干扰NOS的信号通路，在一项动物研究中发现，CMECBH4表达水平上升可有效抑制或是缓解因糖尿病所致的NO依赖血管舒张损伤［9］。此外，ROS作为CMEC损伤的病例因子，其表达水平上升可使NO降解加速，采用活性氧清除剂干预CMEC亦可明显增加NO生物的利用度，改善机体血管功能，提示ROS在NOS信号通路中有负调控的作用。此外，亦有其他相关的信号通路同样参与了NOS的活性调节。相关研究发现，PI3K/AKT通路可激活人源eNOS，促使CMEC加速释放NO，进而可缓解因缺血再灌注所诱发的受损血管功能［10］。上述可知，在CMEC中，NOS受多种辅助因子、底物以及酶的调控，且PI3K信号通路在eNOS酶活性的调控中可能发挥着重要作用。

细胞代谢通路紊乱

细胞的代谢功能在机体细胞分化期间和生物功能极为重要，机体如果出现如高游离脂肪酸、高血糖等代谢紊乱情况，亦可导致患者心血管事件发生的风险增加。有关研究表明糖尿病患者血管细胞代谢及心肌出现异常情况可能是促使其发生相关心血管事件的主要原因［11］。此外，患者冠状动脉功能障碍亦可促使心肌供血异常，进而引发糖尿病性心肌疾病。在高糖引起的细胞代谢异常期间，ROS的大量累积和细胞凋亡信号通路是导致CMEC受损的重要分子事件。CMEC在高糖的环境下其葡萄糖代谢表达水平更高，而在这种情况下ROS表达水平亦会随之升高，现阶段已发现竞争性糖酵解抑制剂2-DC可有效降抑制因高糖诱导的血管内皮细胞中的超氧化物生成，由此可知，由高糖所诱发的高水平糖酵解是血管内皮细胞中的超氧化物持续生成的主要因素。此外，相关研究发现，机体高糖状态未改eNOS以及iNOS表达水平产生影响，但其降低了机体细胞中的谷胱甘肽（GSH）表达水平，提高了NAD（P）H氧化酶膜结合组分p22-phox的水平表达，同时发现，CMEC内氧自由基主要来源于NAD（P）H，由此认为，高糖所致CMEC氧化应激异常的原因可能与抗氧化蛋白表达水平降低促氧化酶活性提高相关［12］。现阶段关于高糖对GSH的调控机制未完全阐明，关于血管平滑肌的相关研究结果仅表明，高糖所诱发的抗氧化蛋白表达水平异常可能与GSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）水平及活性相关［13］。但对于能否可类推至CMEC尚未确定。另外，高糖所致的代谢异常亦可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，随后抑制了细胞自噬过程，进而促进CMEC凋亡。近年来亦有相关研究证实，临床用于治疗CMEC的尼可地尔可通过促进细胞自噬用以保护晚期糖基化终末产物所致的CMEC损伤，故细胞自噬亦可能是高糖状态诱发CMEC损伤的干预靶点之一［14］。由上述认为，高糖状态所诱发的CMEC损伤机制可能是多方面的。除高糖损伤血管外，高脂肪酸血症也会导致心脏微血管损伤，同时机体游离脂肪酸异常也会导致CMEC发生损伤，围脂滴蛋白5属于重要的脂肪酸代谢蛋白，围脂滴蛋白5异常降低亦可导致脂滴减少，游离脂肪酸浓度增加进而促使ROS大量生成，导致eNOS活性及表达水平显著降低，最终CMECNO促使血管内皮细胞发生凋亡。正常情况下血管内皮细胞均通过代谢的方式进行糖酵解，而受脂肪酸水平上升的刺激下亦会导致内皮细胞转向给予依赖氧化脂肪酸提供能量，在此期间会使ROS大量产生，进而导致内皮细胞功能发生障碍，因此，在临床治疗中，关于脂肪酸代谢异常的情况亦不可忽视。

细胞衰老信号通路活化

衰老属于影响心血管疾病公认的独立危险因素。在一项动物研究中发现，冠状动脉血流储备（CFR）功能及内皮依赖性血管舒张随着年龄不断上升而持续减少［15］。其相关机制可能与机体舒张因子分泌量降低、细胞失活以及收缩因子释放相关。血管内皮功能受到损伤后，舒张因子所发挥的抑制作用相对降低，进而导致机体血小板和免疫细胞大量聚集，直接影响机体内皮细胞功能。近年来有相关研究发现，与机体衰老相关的Sirtuins家族蛋白直接参与了CMEC功能障碍［16］。在动脉粥样硬化（AS）以及衰老中，微血管内皮细胞miRNA 217的水平上升，进而抑制身为Sirtuins家族一员的沉默信息调节因子1，促使细胞内皮信号发生改变同时eNOS活性下降，进而导致血管内皮细胞功能发生障碍。此外，Sirtuins家族中的另一个成员沉默信息调节因子3可随着机体衰老而持续降低，其主要位于线粒体，对细胞代谢以及线粒体具有调节作用，同时亦可帮助机体心肌细胞抵抗衰老和应激损伤。Sirtuins家族在衰老过程中对机体内皮细胞功能所发挥的作用可能与Sirtuins家族蛋白去乙酰化酶调控线粒体应激反应及调控线粒体的代谢相关。此外，ROS同样参与了CMEC的衰老过程，相关文献表明，ROS表达水平上升可导致CMEC的细胞周期发生增殖抑制、停滞等，使其出现衰老表型，而FOXO3作为与人类长寿相关联的蛋白质，其通过抑制ROS信号通路后可有效延缓CMEC衰老，此外，衰老会提高如肿瘤坏死因子-a（TNF-α）等脂肪来源的细胞因子表达水平，这亦是促使CMEC功能发生障碍的重要因素［17］。

炎症信号激活

炎症信号在CMEC功能障碍的发生以及发展中发挥了极为重要的作用，炎症因子可导致内膜增厚、血管内皮损伤，亦会导致血管内皮细胞NO和前列环素合成及其类似物合成减少，同时亦可激活机体免疫细胞进一步释放免疫激活物，进而促使内皮功能发生异常［18］。在炎症信号被激活的状态下，机体血管细胞黏附分子-1以及黏附分子的表达水平亦会增加，同时整合素受体亲和力上升后，其在血管内壁中的滚动将会受到一定抑制，在细胞趋化因子作用下进行迁移浸润，进而导致内皮细胞功能损伤。正常组织中的NOD样受体蛋白同样参与了CMEC损伤过程，受缺血再灌注影响，CMEC的NOD样受体蛋白水平增高，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的活性上升，白细胞介素-1（IL-1）及IL-18表达水平明显提高，诱发局部出现炎性反应，进而导致内皮细胞功能受损。原因可能与缺血再灌注期间的激活NOD样受体蛋白相关。此外，在相同的体系中放入ROS清除剂之后，NOD样受体蛋白与NLRP3炎症小体之间的相互作用解除，且下游信号亦会明显受到抑制，提示，ROS亦可能是激活NLRP3炎症小体上游信号。此外，有关研究发现，在心肌细胞中很少出现NLRP3蛋白表达，但其在CMEC中存在表达，这亦进一步说明，NLRP3炎症小体在CMEC病理的发生、发展中发挥了关键作用［19］。

CMEC的提取和鉴定

现阶段有关CMEC的相关研究多选择大鼠原代CMEC作为研究对象，但原代CMEC的培养、纯化以及分离等相关实验步骤的难度相对较大，且分离期间常会引入平滑肌细胞、纤维细胞等杂细胞，同时在传代期间亦会丧失细胞的部分特性，导致细胞活性及纯度下降，进而导致关于CMEC的研究难度受到极大限制［20］。而随着医学技术的不断发展与进步，关于CMEC分离纯化的研究取得了巨大进步，现阶段已有包括磁珠、组织块贴壁以及双酶消化法3种分离法。而关于CMEC的鉴定主要包括标志物鉴定以及形态鉴定。

总结与展望

随着对CMEC的持续研究，关于CMEC相关的病理分子机制已逐渐得以揭示，本研究综述了关于CMEC功能障碍的相关研究进展，其中包括衰老、代谢、ROS、NOS以及炎症等信号传导，其涉及的相关分子机制较为复杂，但就目前相关研究可知ROS处于CMEC损伤的核心区域，在高糖、缺血、高血压以及高游离脂肪酸所诱发的细胞损伤中，虽然触发多种信号通路，促使细胞凋亡、NOS的活性降低、代谢异常等细胞表现，但究其根本均ROS的大量积累发挥了极为重要的作用。目前已阐明部分有关ROS与CMEC损伤的信号通路，但具体机制及因果关系还需对其进一步研究，但ROS在CMEC中发挥的功能是可以确定的。此外，虽然已有部分保护CMEC功能的相关药物研究，但针对CMEC干涉药物直接转化至临床应用的相关报道较少，有关上述诊断及相关治疗的问题仍是今后需要研究的重点。冠状动脉微血管疾病的发病机制较为复杂，其涉及众多组织及细胞，除CMEC外，心肌细胞、血管平滑肌细胞以及免疫细胞等均参与了冠状动脉微血管疾病的发生与发展。本研究仅综述了部分CMEC损伤的相关分子机制，而了解冠状动脉微血管疾病还需今后更为全面进行解析各种细胞信号传导以及组织之间的交叉对话。随着医学水平的不断发展及分子生物学技术持续进步，相信关于冠状动脉微血管疾病的问题将会被逐渐揭示。