外泌体在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究进展

李昕玺 刘长梅 祝慧 翟淼浡 商雪 赵嘉昊 徐会圃

1滨州医学院附属医院心血管内科，滨州 256600；2滨州医学院附属医院内分泌科，滨州 256600

目前，急性心肌梗死的发病率不断增加，已成为全世界范围内重大的公共卫生问题。而在急性心肌梗死患者的治疗中，溶栓、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）以及冠状动脉旁路移植（CABG）等心肌再灌注治疗是减少梗死面积、挽救濒死细胞的有效治疗策略。然而，再灌注治疗在挽救心肌的同时也可诱发心肌顿抑、再灌注心律失常和无复流现象等一系列心脏不良事件，引起心肌缺血再灌注损伤（MIRI）［1］，影响患者预后。目前针对MIRI尚缺乏有效的治疗策略，因此，探索改善缺血再灌注损伤的机制、预防或减轻缺血再灌注损伤，将有助于改善急性心肌梗死患者的预后。

外泌体是由细胞主动分泌的具有双层脂质膜结构的小囊泡［2］，能够通过转运细胞内的相关物质（包括酶、细胞因子、DNA和非编码RNA等）参与细胞间通讯［3］。其最早是在二十世纪80年代由Johnstone等［4］在绵羊网织红细胞体外培养的过程中发现并命名的。随着对外泌体研究的日益深入，研究者们发现外泌体在体内众多生物过程中均起着重要作用，如细胞分化、炎性反应、抗原提呈、免疫应答以及肿瘤发生发展等。几乎所有的细胞类型均可分泌外泌体，其表面标志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2互作蛋白X（Alix）、肿瘤易感基因101（TSG101）、热休克蛋白27（HSP27）等［5］。2007年，Gupta和Knowlton［6］首次报道缺氧复氧条件下培养的心肌细胞能够释放外泌体。外泌体在心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞之间可以充当细胞间通讯信使，并参与心血管疾病中细胞再生、心室重塑和血管生成等过程的调节［7］。在过去十年中，随研究的不断深入，外泌体已成为心血管疾病重要的治疗手段或生物标志物之一，本文将对外泌体、MIRI以及外泌体对MIRI作用机制进行探讨。

MIRI的机制

MIRI与分子、细胞以及组织改变如氧化应激、炎症、中性粒细胞活化以及细胞死亡等过程均有关。而再灌注损伤的主要介质是氧自由基、钙负荷和中性粒细胞等［8］。

1、氧自由基损伤

氧自由基性质极其活泼，能够诱导体内其他物质的氧化修饰，其产生在冠状动脉闭塞再灌注后的前几分钟达到高峰［9］，能够导致胞膜的不饱和脂质或蛋白质过氧化，线粒体是氧自由基攻击的主要目标。虽然氧自由基可以被体内的超氧化物歧化酶（SOD）催化为过氧化氢，但在急性缺血损伤后细胞水平的SOD急剧减少，打破了这种平衡，并为随后再灌注后氧自由基的激活提供了基础［10］。有研究建立了MIRI犬模型，在再灌注期间给予SOD和过氧化氢酶（CAT）清除氧自由基后，虽然梗死面积没有显著减少，却显著改善再灌注期间的局部心肌血流量并保存了严重受损心肌细胞区域微血管的超微结构［11-12］。因此再灌注过程中氧自由基还可以通过损伤微血管导致心肌组织损害。

2、炎性反应

当机体受到侵犯时，特殊分化细胞（如巨噬细胞等）会识别并启动炎症的级联反应，而中性粒细胞会快速识别这种反应，移动到启动并释放促炎介质的地方来发挥作用。而生理状态发生改变时，中性粒细胞这一反应可致组织损伤。在MIRI的过程中，损伤的心肌细胞以及血管内皮细胞发出炎症信号［13-14］，导致中性粒细胞移动并激活，释放能够损伤再灌注区域内邻近内皮和心肌细胞的毒性产物，包括蛋白水解酶、血小板活化因子和氧自由基等，引起自身组织的破坏。同时，该过程常伴随着促炎细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1和IL-6［14］。这些细胞因子反过来诱导内皮、中性粒细胞和心肌细胞表面黏附分子暴露，并刺激IL-8的释放，能够显著促进炎症以及中性粒细胞的激活。有研究表明，MIRI时心肌释放的细胞外热休克同源蛋白［15］，可以通过Toll样受体4（TLR4）信号在缺血后的炎性反应中起关键作用［16］。

3、线粒体功能障碍

在再灌注过程中，氧重新进入心肌细胞会对线粒体信息传递链造成损伤，增加氧自由基的产生。而线粒体Ca2+超载和氧自由基产生增加都促进线粒体膜上的非选择性通道线粒体膜通透性转化孔（PTP）的开放，使细胞能量紊乱，导致不可逆的细胞坏死和凋亡［17］。PTP的开放成为致死性再灌注损伤的关键决定因素。在心肌缺血期间，线粒体PTP保持关闭状态，仅在心肌再灌注后的前几分钟内开放，以应对线粒体Ca2+超载、氧化应激、H+浓度升高以及三磷酸腺苷（ATP）的消耗。而缺氧时间较长导致缺氧严重时，PTP开放时间过长，使线粒体膜电位严重失衡导致氧化磷酸化解偶联，最终出现ATP耗竭以及细胞死亡。

另外，随着心肌细胞的缺血缺氧，细胞以及胞膜功能障碍，各种代谢以及离子转运紊乱，Ca2+顺膜内外离子浓度差进入细胞内；同时，H+作为无氧糖酵解的结果在细胞内积累。灌注恢复后，为了使细胞内pH值正常化，H+被转运到胞外来交换Na+。细胞内Na+的增加激活2Na+/Ca2+转运体，导致细胞内Na+与细胞外Ca2+的交换。高比率的Na+/Ca2+交换会导致Ca2+超载和细胞死亡［18］。另有其他研究发现，心肌缺血再灌注时还可以通过Rap1等途径促进心肌细胞凋亡，引起相应的心肌损害。

外泌体对MIRI的作用

外泌体是细胞主动分泌的胞外小囊泡。既往的研究表明，多种细胞来源的外泌体能够分泌细胞因子、生长因子以及趋化因子等。生理状态下，细胞可以释放少量的外泌体，而在一定的内、外刺激（如信号通路激活、应激等）情况下，可以诱发细胞分泌大量的外泌体。缺血缺氧对组织器官来说是巨大的刺激，多种细胞分泌的外泌体均发生变化，这些外泌体首先进入周边细胞外液，并最终汇聚于血液循环中到达靶细胞、靶组织而发挥相应作用。外泌体是有着双层膜结构的带负电荷（-26 mV）的微粒，并表达CD63、CD81等表面分子，这些特性使得它易于被MIRI心肌细胞摄取吸收，并递送其携带的生物活性分子。有研究表明外泌体是新生血管形成、细胞增殖和凋亡过程中的重要调节因子［19］，能够通过多种机制改善缺血再灌注后损伤的心肌以及心功能。

1、抑制炎性反应

炎性反应是导致MIRI的一个重要机制。在MIRI小鼠模型中，再灌注后给予骨髓间充质干细胞来源外泌体的小鼠与对照组小鼠相比，心肌梗死面积减少，炎症细胞浸润减少；同时，外泌体处理后的小鼠心脏组织中促炎因子IL-6减低更显著，而抗炎因子IL-10的浓度则显著增加［20］。而大鼠M2型巨噬细胞来源的外泌体可以通过携带miR-148a来下调硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表达并使TLR4/NF-κB/NLRP3炎性体信号通路失活以减轻MIRI［21］。另外，SIRT7可以参与心肌细胞凋亡和应激反应的调节，且其表达随着急性心血管损伤的加重而增加，在缺血再灌注心肌组织和细胞中SIRT7表达上调，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过转运miRNA-125b来负性调节SIRT7从而抑制心肌细胞炎症应激以及细胞凋亡，减轻缺血再灌注损伤［22］。

2、抗氧化应激

氧化应激是导致缺血再灌注损伤的重要原因之一。在相关研究中发现，在再灌注后30 min内，外泌体处理后动物的ATP/ADP和NADH/NAD+比率显著增加［23］。同时，作为心肌缺血/再灌注损伤的标志特征，氧化应激的程度在再灌注的第1小时内也有一定程度的降低。这表明，外泌体治疗在引发快速生化反应以恢复ATP和NADH水平以及减少氧化应激方面效果较为显著。另外，陈琮［24］对MIRI的小鼠分别予以等量的外泌体以及生理盐水治疗，与生理盐水治疗的对照组相比，外泌体治疗组小鼠心肌中ATP和NADH的水平明显增加，同时，增加了磷酸化的Akt和磷酸化的GSK-3β，并减少了磷酸化的c-JNK，而经过外泌体治疗的小鼠，减低了氧化应激，心功能得到明显改善。外泌体的抗氧化应激的功能一定程度上可以改善MIRI的预后。

3、诱导自噬减轻细胞凋亡

细胞缺血或缺氧损伤后的自噬增强具有一定的心肌保护作用，而缺血再灌注后过量氧自由基的产生可以导致细胞自噬功能的降低。研究发现，H2O2诱导的H9C2心肌缺血再灌注模型中，自噬蛋白LC3B-Ⅱ水平降低，同时，作为自噬退化的标志，P62在暴露于H2O2的H9C2心肌细胞中相对于对照组显著降低；为进一步观察外泌体对细胞自噬的影响，用Baf-A1抑制细胞自噬后，与仅H2O2组相比，在H2O2+外泌体组中，自噬基因Beclin-1和LC3B-Ⅱ的表达显著增强，P62的表达显著降低，且与H2O2暴露组相比，外泌体处理组的自噬体和自噬溶酶体均显著增加［25］。同时，骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以通过调节AMPK/mTOR途径增强心肌细胞自噬。另外，缺血再灌注期间心肌细胞外泌体的释放能够减少体外缺氧导致的心肌细胞凋亡［26］。

4、促进血管新生

心肌缺血后血管再生保证血液以及氧供是减轻损伤的关键措施。有研究表明，来源于远端缺血预处理大鼠血浆中的外泌体可以通过促进HSP70的表达显著提高细胞活力，增加内皮细胞细胞分裂G1期的细胞百分比、细胞迁移、增殖、血管形成并抑制细胞凋亡，同时还可以通过引起的iNOS、缺氧诱导因子（HIF）-1α、Ang-I和血管内皮生长因子（VEGF）的显著表达增加来促进血管再生，从而减轻缺血再灌注损伤［27］。Ma等［28］研究发现，给小鼠缺血心脏移植表达miR-132的外泌体后明显增强了梗死周边区的新生血管形成，保护了心脏功能。

5、减少梗死面积，减轻心肌重塑

心室重塑是导致患者发生心力衰竭，影响急性心肌梗死患者远期预后的主要原因。Yu等［29］发现，在人间充质干细胞中存在过表达锌指转录因子-4（GATA1 binding factor-4，GATA-4），将急性心肌梗死兔模型给予间充质干细胞来源的外泌体处理后，发现心肌梗死面积明显减小。同时，有研究表明，骨髓间充质干细胞衍生的外泌体能够通过PI3K/Akt途径减轻心肌细胞重塑，而该途径还是一种常见的细胞自噬途径，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过该途径抑制心肌重塑，促进细胞自噬，从而减轻MIRI［23］。

展望

外泌体通过在细胞间传递功能蛋白等物质，可以对损伤的修复和恢复产生即时的生理反应，是一种体内理想的载体。不同细胞来源的外泌体可以分泌细胞因子、趋化因子和生长因子等，这些因子可以主要通过促进心肌和血管组织的生长和再生来修复受损的心脏组织，从而减轻MIRI。外泌体这些作用为我们研究组织损伤和修复的细胞间调节提供了新的视角，并为组织修复生物制剂的开发提供了新的途径，同时也为我们探究外泌体新的功能提供了思路。如果外泌体可以激活心脏保护途径，那么我们可以通过操纵它在血液中的浓度来进一步影响心脏保护机制。目前尚未开发出用于体内改变外泌体产生的特定药物制剂。最近有许多研究提出采用肢体远端缺血预处理可以增加血液中外泌体的数量并改变转运物质来发挥相应的心脏保护作用。同时，我们猜想外泌体参与心脏保护可能代表了外泌体在参与组织修复中的一般功能。不同的细胞类型可能会产生针对特定类型细胞或损伤的外泌体，这些外泌体极有可能成为诊断疾病以及判断预后的有效生物学标志。