模式识别受体与慢性牙周炎的研究进展

王正安，符起亚

（海南医学院口腔医学院，海南 海口 570100）

慢性牙周炎是口腔两大疾病之一，影响着全世界的大量人口。牙周炎是一种慢性炎症状态，导致支持牙齿的硬组织和软组织的破坏［1］。其病因涉及多种因素，如牙周致病菌、局部促进因素、遗传因素和吸烟习惯等［2］。牙周炎的发生发展不只是由牙周致病菌引起，更是由宿主的免疫炎症反应介导的。然而，宿主的炎症反应受信号通路的控制。因此，信号通路的失调是牙周炎发病的潜在机制［1］。

PRRs 是一类模式识别受体，具有多个家族成员，包括Toll 样受体家族（TLRs）、C 型凝集素受体家族（CLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体家族（RLRs）和核苷酸结合寡聚域（NOD）样受体家族（NLRs）［3］。PRRs 通过识别牙周病原体，激活下游信号通路，最终影响细胞因子和防御素的产生，在调节宿主对牙周病原体的天然免疫反应中起重要作用，因此，本文就PRRs 在牙周炎中的作用作一综述。其中RLRs 是从RNA 病毒中识别dsRNA 的细胞质受体，与慢性牙周炎的关联较少，故不做阐述［4，5］。

1 TLR 与慢性牙周炎

1.1 TLR 的分类与表达

Toll 样受体（TLRs）属于I 型跨膜分子，能够感知病原体相关分子模式（PAMPs）并激活宿主免疫反应。到目前为止，已经在人类中发现了10 个TLRs（TLR1～TLR10），在小鼠中有12 个。每个TLR 驻留在细胞的特定部分并能够感知不同的PAMPs［6］。基于它们识别的PAMPs 的组成，TLRs可分为两类。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10 存在于细胞膜中，可以识别多种PAMPs，包括脂多糖、磷脂、酵母多糖、鞭毛蛋白和肽聚糖。相反，TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 存在于细胞质中，主要识别由核酸组成的PAMPs［7］。

在人类基因组中已经鉴定出TLR11，但未翻译成蛋白质。TLR2 与TLR1 或TLR6 形成异二聚体，识别肽聚糖、脂肽和脂蛋白，而TLR4 识别革兰氏阴性菌脂多糖。TLR3 识别双链RNA，TLR5 可检测细菌鞭毛蛋白，TLR7 和TLR8 可以识别病毒单链RNA，TLR9 通过胞嘧啶和鸟嘌呤碱基配对识别细菌和病毒DNA［8］。

1.2 TLR 的结构

Toll 样受体由一个马蹄状细胞外富亮氨酸重复序列（LRR）和跨膜区和细胞内区（Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR）3 部分组成。LRR 结构域负责配体识别，细胞内信号传递由TIR 结构域负责［9］。

1.3 TLR 的信号传导

TLRs 与配体结合后，细胞内TIR 结构域的构象变化导致同型TIR-TIR 相互作用招募适配器蛋白，从而促进下游的信号传递。目前，已知有5 种TLR 适配器蛋白：髓样分化因子88（MyD88）、含有适配器分子的TIR 结构域（TRIF）、MyD88 适配器样蛋白［MAL，也称为含有适配器蛋白的TIR 结构域（TIRAP）］、TRIF 相关适配器分子（TRAM）和SARM（sterile-and armadillo-motif-containing protein）［10］。一般来说，TLRs 主要通过两个途径传递信号，依赖于适配器MyD88 和TRIF 信号轴。MyD88 信号主要导致促炎细胞因子的产生如TNF、IL-6、IL-1 和趋化因子（如C-C 基序配体4，CCL4），而TRIF 轴主要诱导I 型IFNs（例如，IFNα/β）的表达。大部分的TLRs 通过MyD88 依赖的机制传递信号，而TLR3 只通过TRIF 信号轴转递［11］。

经典的依赖型MyD88 通路传递信号是通过C端结合TLR 细胞内TIR 区域，MyD88 的N 端将招募IL-1R 相关激酶4（IRAK4），并通过其中心激酶结构域（KD）的自磷酸化激活，激活IRAK1 和IRAK2。从而MyD88、IRAK4 和IRAK1/2 结合形成受体复合物，这种异质异构结构由MyD88 的分子和IRAK4 和IRAK1/2 成员组成，称为Myddosome。随后诱导E3 泛素（Ub）连接酶TNF 受体相关因子6（TRAF6）的激活，同时触发3 条主要的转导途径，最终激活3 个关键的转录因子（如NF-κB、干扰素调节因子（IR F）和丝裂原活化蛋白激酶MAPK）。

第一条途径，激活的TRAF6 与TGF-β 活化激酶（transforming growth factor-βactivated kinase，TAK）-1、TGF-β 活化激酶-1 结合蛋白（transforming growth factor-βactivated kinase-1 binding protein，TAB）-1 和TAB2/3 组成形成新的复合物，进入细胞 质。刺激由IKK-α、IKK-β 和NEMO（又 称IKK-γ）组成的复合物蛋白激酶（inhibitor-κ-binding kinases，IKK）的激活。促使NF-κB（IKBα）抑制剂的磷酸化和降解，使NF-κB（包括亚基p50 和p65）释放及转移到细胞核。转录调节细胞因子和趋化因子的释放，诱导炎症反应和启动固有免疫。第二条途径，MAPK 通路是在TAK1 复合物的下游诱导转录因子激活蛋白-1（AP-1）和CREB 的激活。第三条途径，TRAF6 通 过TAK1-IKK-β 通 路，激 活IFN的调节因子5（IRF5）［12.13］。TLRs 不仅是对真菌、细菌和病毒病原体进行免疫防御的最重要机制，也是最早的机制之一。因此，在口腔中大量的微生物共生条件下，TLRs 的表达和功能在维持口腔组织稳态中是必不可少的［14］。

1.4 TLR 在慢性牙周炎的作用

密集的口腔共生微生物环境使牙龈保持在轻度激活状态，而保持内环境的稳态以便能够直接应对致病的挑战具有重要意义。在口腔中，TLRs 不仅参与构建和维持宿主-微生物稳态。而且在口腔共生微生物刺激下，通过TLR 信号导致AP-1（激活蛋白1）和NF-κB 等信号转导蛋白的产生和激活，进而诱导中性粒细胞趋化因子CXCL2 和CXCL8 的表达，募集中性粒细胞抵御微生物入侵，从而维持口腔健康［15］。

在牙周组织中通过TLRs 识别PAMPs 而产生大量促炎因子及趋化因子，可以引起牙周组织的炎症反应。口腔上皮中的TLR2 和TLR4 可对大部分牙周致病菌产生反应，而其可溶形式sTLR-2，sTLR-4 也可以通过结合微生物配体发挥调节作用。AlQallaf 等团队通过分别收集40 例牙周炎和牙龈炎患者未经刺激的唾液中发现，sTLR-2 水平牙龈炎队列中的临床参数呈负相关，而sTLR-4 水平呈正相关。但在牙周炎队列中，这两种相关性都消失了，表明宿主反应失调［16］。Wang 等［17］研究也发现：与健康唾液组相比，牙周炎唾液组中的SECs 数增加，GSI/SEC 升高，可溶性Toll 样受体2（sTLR-2）降低。经过非牙周手术治疗后，SECs 的数量减少，GSI/SEC，sTLR-2 升高。因此，提示sTLR-2 可以作为牙周病的间接指标。Kim 等［18］用蜂毒肽对牙龈假单胞菌LPS（PgLPS）处理HaCaT人角质形成细胞系中发现，PgLPS 可增加TLR4 和促炎因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL-6、IL-8 和干扰素γ（IFN-γ）的表达。而蜂毒肽通过抑制NF-κB 信号通路、ERK 和Akt 的激活来抑制促炎性细胞因子的表达。

关于TLRs 在牙周炎中基因层面的研究主要集中在基因的甲基化和基因的多态性上。Shaddox等［19］研究发现：与健康对照组相比，中度局部侵袭性牙周炎（LAP）的受试者表现为上调炎症的基因（如：MAP3K7、MYD88、IL6R 和RIPK2）和下调炎症的基因（如：FADD、IRAK 和PPARA）的高甲基化，而重度LAP 则表现为上述所有基因的低甲基化。CPG 位点的甲基化与LAP 患者促炎细胞因子增加有关。研究结果表明，TLR 信号传导通路中基因的表型改变可能通过协调阈值来平衡疾病过程中组织损伤，因此，中度LAP 表现为高甲基化，严重LAP 表现为低甲基化。Zhang 等［20］研究发现：首次证明了转化生长因子β（TGFβ）抑制TLR-NF-κB 信号通路的能力是由蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）诱导的Smad6 甲基化介导的。然而，Smad6 甲基化的紊乱能加剧实验性牙周炎的炎症和骨丢失。因此，PRMT1-Smad6 信号的调控可作为一种新的策略来调节牙周炎的宿主免疫反应。又有 Shan 等［21］通过 meta 分析发现TLR-2rs1898830、rs5743708 多态性可能与牙周炎易感性有关。Leite 等［22］研究亦证实了TLR1-rs5743611、TLR4-rs7873784、TLR7-rs3853839 和TLR8-rs3764879 的基因多态性与青少年牙周炎有关。

2 CLR 与慢性牙周炎

2.1 CLR 的命名与结构

C 型凝集素（C-typelectin）指的是以Ca2+依赖的方式识别碳水化合物配体（Ca2+-dependent）的动物凝集素，与其他非依赖Ca2+的动物凝集素区分开来。其中“C”表示“Ca2+”.无论碳水化合物或钙结合能力如何，用一个更普遍的词“含C-凝集素结构域的蛋白质”（CTLDCs）用来定义这些蛋白质，而其特征是至少有一个或多个C 型凝集素样结构域（CTLD）［23］。

CTLD 典型的特征是一个双环结构，在环的底部由两个高度保守的二硫键桥稳定，以及由一组保守的疏水和极性相互作用。整个域是一个循环，它的N 端和C 端b 链（b1，b5）紧密地连接在一起。第二个循环，被称为长环区域，位于域内，长环区域在结构上和进化上是灵活可变的，它参与钙依赖的碳水化合物结合，以及与其他配体的相互作用［24］。

2.2 CLR 的分类与表达

CTL 作为一种重要的PRR，对病原体表面的各种PAMP 具有很高的亲和力，通过协调先天和适应性免疫系统并在宿主防御微生物感染中发挥作用［25］。在脊椎动物中，髓系CTL 主要由抗原提呈细胞（APC）如树突状细胞和巨噬细胞表达。APC 感知病原体，将它们吞噬内化，并将主要组织相容性复合体（MHC）上的病原体衍生肽呈现给T 细胞，从而启动适应性免疫反应［26］。

C 型凝集素受体（CLRS）分为跨膜型和分泌型，包含至少有一个碳水化合物识别域（CRD），约有120个残基。跨膜型CLR 根据保守型糖类识别区域（conserved carbohydrate-recognition domains，CRD）的个数又分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型CTL 包括巨噬细胞甘露糖受体（MMR）、甘露糖受体2（也称为Endo-180），Ⅱ型CTL 包括dectin-1 和dectin-2，巨噬细胞诱导CTL（Mincle）和（DC-SIGN），主要在髓系细胞上表达，并参与抗真菌免疫［26］。Ⅰ型CTL 通常包含多个CRD，但II型CTL 通常只有一个CRD［27］。分泌型CLR 包括集蛋白、表面活性蛋白A 和D（SP-A、SP-D）、甘露糖结合凝集素（MBL）［28］。

2.3 CLR 的信号传导

CTL 介导的信号触发各种效应功能，如促炎细胞因子的产生，从而影响T 细胞的活化和极化，以及与其他受体（如TLRs）的相互作用［29］。在CTL的细胞质尾部有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）或抑制基序（ITIMs），与ITAMs 这些受体的连接会引起信号级联反应，导致转录因子的激活。而与ITIMs 受体连接会抑制转录因子的激活［30］。

典型的CTL 信号通路之一是由激酶Syk 与各自CTL 的细胞质尾部的ITAMs 或ITAMs 直接或间接相互作用介导的。CLRs 用含有ITAM 的FC受体γ（FcRγ）链招募Syk，或者在CTL 的尾部的细胞质中的单个YxxL 基序，称为HEMITAM，使Syk直接结合，而不涉及额外的适配器蛋白。因此，Syk被磷酸化，从而启动由caspase 募集结构域蛋白9（CARD9）、B 细胞淋巴瘤/白血病10（Bcl10）和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1（MALT-1）组成的三元蛋白复合物的组成。称为CARD9/Bcl10/MALT-1 复合物，导致转录因子的激活（如NF-κB、NFAT 或AP-1），并诱导细胞因子基因的表达。Syk 激酶的激活也可能导致ROS 的产生，从而诱导炎症小体的激活和IL-1β 的产生。然而，CTL 信号也可以是独立于Syk 这一途径的。DC-SIGN 通过不同途径激活Raf-1 激酶，最终导致NF-κB 的激活［31，32］。

2.4 CLR 在慢性牙周炎中作用

巨噬细胞诱导的C 型凝集素受体（Mincle）又称Clec4E 和Clecsf9，属于Ⅱ型跨膜受体，是一种FcRy 偶联的病原体识别受体。Mincle 识别不同的含糖配体，包括分枝杆菌的海藻糖二环酸糖脂、真菌病原体的甘露糖或含葡萄糖糖结合物、甘露糖或含岩藻糖的新糖结合物以及幽门螺杆菌的LPS［33］。福塞斯坦菌是一种口腔革兰阴性厌氧菌，位于牙龈龈下组织，参与牙周炎的发展。Chinthamani 等［34］研究发现通过直接配体结合试验，发现Mincle 特异性结合福塞斯坦菌的S 层糖蛋白，导致巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-a 和抗炎细胞因子IL-10 的分泌。因此，Mincle 介导的信号通路产生的TNF-a、IL-10可能对牙周炎的发病机制有直接的影响。

甘露糖结合凝集素（MBL）是一种存在于人体血液中的可溶性糖蛋白。它通过与MBL 相关丝氨酸蛋白酶形成复合物来启动补体系统的凝集素途径。这种复合物可以与革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的表面结合，从而激活补体系统［35］。MBL 突变会削弱其对细菌的亲和力，从而影响其激活补充系统的 能力［36］。Liukkonen 等［37］研究表明：牙周病原菌放线菌与牙周组织炎症和破坏和人类MBL2 的遗传变异有关。

3 NLR 与慢性牙周炎

3.1 NLR 的命名和结构

含有（NLR）蛋白的核苷酸结合结构域（NBD）和富含亮氨酸的重复序列（LRR）是一个细胞内受体家族，在调节天然免疫反应中起着重要作用［38］。NLR 蛋白是一个保守的三方结构，其中一个是C-末端富含亮氨酸的重复结构域（leucine-rich repeat，LRR），负责配体的识别，一个是中央核苷酸结合的寡聚结构域（NOD）和一个N 末端蛋白-蛋白相互作用结构域（通常称为效应结构域），负责细胞内信号传导［39］。NACHT 结构域（又称NBD 或NOD 结构域）属于NTP 酶结构域的一个大超家族，它水解ATP 或GTP。LRRs 称为蛋白质-蛋白质相互作用结构域，可以与许多其他分子相互作用，是一个配体识别域，定义了NLR 蛋白对特定配体的特异性［40］。

3.1.1 NOD 的结构 NOD1（CARD4）和NOD2（CARD15）是最早描述和研究最多的核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列的受体（NLR）家族，包括人类22 个基因和小鼠30 多个基因，其特征是在N 末端有一个募集结构域（CARD）。NOD1、NOD2 两者都是NLRS 的CARD 亚家族的成员，其中Nod1在N 端包含一个CARD 结构域，Nod2 在N 端包含两个CARD 结构域［41］。

3.1.2 NLRP3 的结构 Nod 样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是由NLRP3、CARD 结构域的凋亡相关颗粒样接头蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）组成的一类炎症复合体。其中上游受体分子NRLP3 属于NOD 样受体家族，与病原微生物结合后能够通过招募ASC、Caspase-1 地聚集及活化来调控炎症反应［42］。

3.2 NLR 的分类与表达

NLR 蛋白家族可按N 端效应结构域分为亚家族。有两个主要的亚家族：CARD 亚家族（称为NLRC 或NACHT、LRR 和CARD 结构域蛋白）和Pyrin 亚家族（称为NLRP 或NACHT、LRR 和PYD蛋白）［43］。

NOD1 和NOD2 这两种蛋白质都能识别细菌细胞壁组分肽聚糖的部分。更确切地说是分别识别γ-D-谷氨酰胺-二氨基苯甲酸（iEDAP）和胞壁酰二肽（MDP）。iEDAP 结构主要存在于革兰氏阴性细菌肽聚糖（PGN）中，而MDP 几乎存在于所有细菌PGN 中［44］。

3.3 NLR 的信号传导

3.3.1 NOD 的信号传导 NOD1和NOD2识别细菌肽聚糖（PGN）后能迅速形成寡聚体，进而通过CARD-CARD 的相互作用招募受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）形 成NOD-RIP2 复合物［42］。这一复合物能引起NF-κB抑制剂激酶复合物（inhibitor of NF-κB kinase complex，IKK）的汇集，进而通过蛋白酶的泛素化和磷酸化降解NF-κB 的抑制剂（inhibitor of NF-κB，IκB），使NF-κB 与其抑制剂分离，导致NF-κB 的激活［45］。研究表明：NOD1 或NOD2 中CARD 的缺失会影响NF-κB 的激活［46］。因此，NOD1 和NOD2的N 端CARD 是信号效应域。一旦激活，Rip2 通过NF-κB 激酶复合物和MAPK 级联的抑制剂打开下游信号级联，如NF-κB，从而产生促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α、IL-12 或IL-8［47］。

3.3.2 NLRP3 的信号传导 NLRP3 炎症小体的形成是对细胞感染、细胞应激或组织损伤的反应［48］。其激活需要两个步骤（启动和触发）。第一步启动，DAMPs 或PAMPs 被Toll 样受体（TLRs）识别，通过依赖型MyD88/NF-KB 信号通路，诱导不活跃的NLRP3、pro-IL-1β 和pro-IL-18 产生，并通过激活NF-κB 导致NLRP3 去泛素化和ASC 磷酸化［49］。第二步触发，涉及DAMPs 介导（包括钾（K）外排、钙（Ca2+）内流、溶酶体失稳断裂、线粒体活性氧（ROS）和线粒体DNA 损伤等），通过促进不活跃的NLRP3、ASC 和pro-caspase-1 的寡聚，将其组装成高分子量的炎症复合体，在寡聚体中，pro-caspase-1被转化为具有生物活性的caspase-1，进而将pro-IL-1β 和pro-IL-18 切割为具有生物活性形式的IL-1β 和IL-18［50，51］。

细胞外ATP 是NLRP3 炎症小体形成的第二步中最有效的刺激物，由细胞应激或损伤，释放细胞外ATP 激活嘌呤能受体7 来传递病原体的入侵信号［52］。新的证据表明细胞外ATP 通过激活嘌呤能受体7 在调节NLRP3 炎症小体中起重要作用，而嘌呤能受体7 是炎症反应的重要启动因子［53］。嘌呤能受体7 是一种阳离子渗透性配体门控离子通道，通过招募半通道蛋白pannexin-1 在膜上形成一个孔，导致K+外流。细胞外ATP 与嘌呤能受体7 的连接可激活磷脂酶D 导致活性氧的产生，消除细胞内的病原体［54］。牙周炎的发病机制与活性氧和抗氧化防御系统之间的不平衡有关。活性氧是多种细胞途径的组成部分，起着抗菌效应分子、信号分子，调节NF-κB 转录等作用［55］。

线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是细胞活性氧的主要来源。活性氧过量积累导致细胞内氧化应激，导致线粒体DNA损伤，线粒体蛋白的氧化，随后是慢性炎症性疾病的发展，如二型糖尿病、高血压和阿尔茨海默病［56］。如果产生过度的活性氧不能被牙周支持组织中的抗氧化防御系统中和，牙周组织就会被破坏，从而发生牙周炎［57］。

3.4 NLR 在慢性牙周炎中的作用

3.4.1 NOD 在慢性牙周炎中的作用 NOD1 和NOD2 受体被发现参与牙周病原体的识别，说明了其在牙周炎中的重要 性［58］。Chaves de Souza 等［59］研究发现：利用野生型小鼠和NOD1 基因敲除小鼠的骨髓源性巨噬细胞进行体外实验，结果表明，NOD1 的缺失显著加重了革兰氏阴性菌诱导的骨吸收，同时伴有破骨细胞数量的增加，说明NOD1 在牙周炎模型中起到了保护骨骼的作用。多形核中性粒细胞（pmn）可以通过吞噬作用和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来对抗感染性微生物［60］。在微生物刺激时，中性粒细胞释放细胞内容物，如颗粒、DNA和蛋白质，形成一个在感染期间抵御微生物的NETs 的细 胞外结构，称为“网状结构”［61］。Alyami等［62］研究数据表明：具核酸杆菌通过上调NOD1 和NOD2 来激活中性粒细胞并诱导其网状结构形成。因此，用CRISPR/Cas9 基因敲除的HL-60 细胞和使用配体抑制剂证实了NOD1 和NOD2 受体参与了具核酸杆菌介导的网状结构的形成。

3.4.2 NLRP3 在慢性牙周炎中作用 NLRP3 已被报道在慢性牙周炎的发展进程中具有重要作用。其中García-Hernández 等［63］研究发现，在牙周炎和不受控制的2 型糖尿病患者中，NLRP3 炎症小体的激活可能导致牙周组织更严重的破坏。Lian 等［64］研究也发现NLRP3 炎性小体小鼠牙周膜成纤维细胞（mPDLFs）中大量表达，结果表明，ROS/TXNIP/Nlrp3 炎症小体途径是通过P.g-LPS 诱导mPDLFs 的炎症反应而导致慢性牙周炎的关键机制。Yoon 等［65］研究表明：细胞内抗氧化酶SOD2 在炎症条件下通过抑制NLRP3 炎症小体-caspase-1-IL-1β 信号通路从而发挥保护作用。Tan等［66］研究发现：二甲双胍能显著抑制牙龈P.g-LPS诱导的人牙周膜细胞（hPDLCs）炎症反应，其特征是由于促炎因子IL-1β 和IL-18 的分泌减少。二甲双胍还显著降低hPDLCs 中核苷酸结合域、富含亮氨酸家族、pyrin 结构域3（NLRP3）和caspase-1 的表达。Isaza-Guzmán 等［67］研究也表明：与健康对照组相比，牙周炎组的NLRP3、ASC 和IL-1β 水平显著增高。侵袭性牙周炎患者唾液中NLRP3 的浓度显著高于慢性牙周炎患者。然而，NLRP3 与慢性牙周炎发病机制的相关研究较少，这也是未来一个新的研究热点。

4 展望

慢性牙周炎是一种常见的口腔疾病，其进展是由宿主免疫与牙周病细菌之间相互作用介导的。虽然牙周病细菌可以直接破坏牙周组织，但由细菌引发的宿主免疫反应功能失调会导致更严重、更持久的损害。模式识别受体（如TLRs、CLRs、NLRs）存在于口腔内的各组织中，是近年来免疫炎症治疗的研究热点。PRRs 通过形成宿主防御的第一道防线，在调节先天免疫中起着举足轻重的作用，进一步充当固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，通过识别PAMPs 和DAMPs 时触发信号传导通路，导致各种转录因子激活，诱导促炎因子和趋化因子的产生，进而加重组织炎症反应。因此，对模式识别受体（PRRs）进行深入研究可为今后探索慢性牙周炎的发病机制提供新的思路，对于临床预防和治疗具有重要意义。

作者贡献度说明：

王正安：执笔撰写；符起亚：审校。