基于网络药理学和分子对接法探索玉屏风散治疗非小细胞肺癌作用机制研究

胡帅航，刘童童，周 彤，李经蕾，王一燃，侯 炜

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029）

据2018 年全球癌症数据统计，肺癌发病率和病死率均居所有癌症类型之首［1］。其主要病理分型中约80%～85%是非小细胞肺癌（NSCLC）［2］。由于肺癌患者早期症状不明显而不予重视，导致大部分患者在初诊时便失去手术切除的机会，对于此类无法手术切除的非小细胞肺癌，同期放化疗、靶向治疗和免疫治疗虽具有一定优势，但长期用药亦不可避免地产生耐药性，同时新兴的免疫疗法具有副作用大、适宜范围小的缺点，故寻找一种副作用小且有疗效的NSCLC 替代或辅助支持疗法意义重大。

长期研究发现，中医药可有效抑制化疗和放疗的毒性反应，并且提高机体的免疫力。中西医联合治疗往往能够提高临床效果，延缓患者生命，改善患者生存质量。中医药通过辨证论治，对于放化疗还具有增效减毒和逆转耐药的作用，有效缓解患者的相关临床症状。相关机制涉及T 细胞迁移，增强免疫并抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡等［3-5］。玉屏风散记载于《丹溪心法》，主要组成为黄芪、白术、防风。具有益气扶正、固表止汗等功效。《医宗金鉴》言其宜于“风邪久留而不散”诸症。林洪生教授立足于辨病与辨证相结合，将玉屏风散用于预防肺癌气虚外感、表虚自汗证及化疗后感冒样综合征的临床［6］。现代研究发现［7］，玉屏风散涉及多个免疫调节系统，可作用于固有免疫、体液免疫及细胞免疫等免疫功能。同时通过多种作用机制对机体产生免疫调节、抗炎抑菌、稳定微生态环境及抗纤维化、抗肿瘤等功能，但由于对该方某些功效机理和分子层面的作用靶点尚不明确，限制了这一方药推广应用。故本文立足经典理论依据，并结合现代化的网络药理学，从分子层面研究玉屏风散的药理机制，为后续试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 有效成分的收集及潜在靶点的预测

以“黄 芪”、“白术”、“防风”为检索词，在TCMSP 数据库［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索相关化学成分，选取满足药动力学（ADME）参数［9，10］的化合物：生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 。提取相应化学成分对应的靶点，查阅相关文献补充TCMSP 中未预测到的已知靶点。上述靶点和后续的疾病靶点统一在Uniprot 蛋白质数据库［11］（https：//www.uniprot.org）中进行标准化。

1.2 疾病靶点的预测

以“non-small cell lung cancer”为关键词，检索Genecard（www.genecards.org）［12］、OMIM（omim.org）［13］、DisGeNET（www.disgenet.org）［14］、Drugbank（www.drugbank.ca）［15］数据库，检索物种为“Homo sapiens”，检索出NSCLC 相关基因。通过EXCAL 软件，选取药物预测的靶点与疾病的靶点的交集靶点，作为“玉屏风散”治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点。并绘制韦恩图。

1.3 玉屏风散“活性成分-靶点网络”构建

玉屏风散“活性成分-靶点网络”主要通过软件Cytoscape3.7.2［16］进行构建和分析。将上述获得的活性成分及靶点关系进行导入以完成相关网络构建，图中以“节点”（node）表示药物分子和相应基因，用“边”（edge）表示两者之间的关系；采用“Network Analyze”插件进行网络特征分析，以筛选其中较为重要的活性成分。

1.4 蛋白质相互作用网络（PPI）与核心靶点

为进一步明确治疗靶点之间的相互作用关系，将1.2 筛选出的潜在治疗靶点导入STRING（https：//string-db.org）网络平台［17］，将蛋白种类定义为“人”，置信度＞0.7 为条件进行筛选，获得蛋白互 作关系。将“node1、node2 和Combine score”信息导入Cytoscape-3.7.2 中，生成以“drgee”值决定靶点直径大小的网络图，以节点度值超过平均值为标准筛选出核心靶点［18］。

1.5 基因富集分析

为探寻核心靶点所涉及的基因功能和信号通路，采用Metascape（http：//metascape.org/）平台对核心靶点靶点进行分析。设置物种为人，进行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

1.6 分子对接

根据上述筛选出的核心成分以及核心靶点，从蛋白质晶体数据库PDB（www.rcsb.org）和TCMSP 数据库下载其结构文件，保存其pdb 格式。运用AutoDock Tools 1.5.6 软件分别准备受体与配体的坐标文件，删除配体中的水分子，分离配体和受体，添加非极性氢，计算Gasteiger 电荷后保存pdbqt格式文件。将潜在核心成分配体进行能量最小化处理，赋予配体原子类型、计算电荷，保存为pdbqt格式。AutoDock Vina 软件采用了复杂的梯度算法及多线程技术，靶点与配体之间的对接活性可以运用分子对接得分值评估，对接得分＜-4.25 可认为配体与靶点之间具有结合活性，得分＜-5.0 则结合活性较佳，得分＜-7.0 两者之间有强烈的对接活性［19］。

2 结果

2.1 活性成分及治疗靶点

通过TCMSP 及已有文献报道检索提取白术化学成分55 种、黄芪化学成分87 种、防风化学成分173 种，以“OB≥30%、DL≥0.18”筛选出活性化合物白术4 种，黄芪16 种，防风17 种，选取活性化合物所对应的靶点，删除重复项目，合并后共获得靶点190 个。方中各药味活性成分见表1。

表1 玉屏风散主要活性成分Tab 1 Main active components of Yupingfeng Powder

通过GenCards、OMIM 等数据库收集到非小细胞肺癌相关靶点共4 350 个，将玉屏风散和疾病相关靶点进行映射取交集共得到146 个交叉靶点，即玉屏风散治疗非小细胞肺癌潜在作用靶点，见图1。

图1 玉屏风散和非小细胞肺癌靶点韦恩图Fig 1 Veen diagram of Yupingfeng Powder and non-small cell lung cancer target

2.2 活性成分-疾病-靶点网络构建

构建活性成分-靶点网络，该网络由227 个节点构成，包括540 条边，其中单个靶点的度值（degree）决定所连接靶点的数量，见图2。

图2 玉屏风散治疗NSCLC 主要活性成分-靶点网络图（度值与靶点大小呈正相关）Fig 2 Main active component-target network map of non-small cell lung cancer（NSCLC）treated by Yupingfeng Powder（The degree is positively correlated with the size of the target）

网络分析表明，槲皮素度值为136，介数0.67822，预测为玉屏风散治疗NSCLC 发挥的主要成分。其次为山奈酚（自由度为51、介数为0.122 94）、汉黄芩素（自由度为37、介数为0.093 82），排名前十的活性成分见表2。

表2 活性成分自由度及介数Tab 2 Degree of freedom and betweenness of active components

2.3 PPI 网络的构建和核心靶点的筛选

将玉屏风散治疗NSCLC 的146 个潜在治疗靶点导入STRING 平台生成PPI 网络，将其导入Cytoscape-3.7.2 使节点度值可视化。该图包含128 个节点（绿色节点）、585 条边，其中节点越大度值越大。根据网络拓扑参数进一步分析，以节点度值＞均值（9.14）为参数筛选出靶点共44 个（红色节点），具体见图3。其中度值、介值大的靶点预测是玉屏风散治疗NSCLC 的关键靶点，其中排名前十的核心靶点见表3。

表3 玉屏风散治疗NSCLC 核心靶点属性参数Tab 3 Attribute parameters of core targets of non-small cell lung cancer（NSCLC）treated with Yupingfeng Powder

图3 PPI 网络图及核心治疗靶点Fig 3 PPI network map and core therapeutic targets

2.4 GO 和KEGG 富集分析

将44 个核心靶点导入至Metascape 平台进行GO 生物过程分析和KEGG 通路富集分析。见图4、5。

图4 核心靶点GO 分析Fig 4 GO analysis of core targets

图5 核心靶点KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of core targets

GO 分析取Metascape 平台分析P 值排名前10的结果，其中生物过程主要包括细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、细胞对脂质的反应（cellular response to lipid）、细胞对生物刺激的反应（cellular response to biotic stimulus）等，细胞成分主要包括水泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒管腔（secretory granule lumen）、胞质小泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、血小板α 颗粒管腔（platelet alpha granule lumen）、血小板α 颗粒（platelet alpha granule）等，分子功能主要包括转录因子结合（transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合（RNA polymerase Ⅱtranscription factor binding）、近端启动子序列特异性DNA 结合（proximal promoter sequence-specific DNA binding）、核心启动子结合（core promoter binding）、染色质结合（chromatin binding）等。

KEGG 富集分析显示玉屏风散治疗NSCLC 涉及多条信号通路，具体包括：AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications），IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway），TNF 信号通路（TNF signaling pathway），NOD 样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway），Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway），MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、癌症相关信号通路（Pathways in cancer）等。

2.5 分子对接

选取核心化合物中排名靠前的槲皮素、山奈酚依次与核心治疗靶点MAPK1、AKT1、TP53、JUN对接，对接得分见表4。

表4 分子对接得分Tab 4 Score of molecular docking

对接得分均＜-5.0，槲皮素、山奈酚与4 个核心治疗靶点具有良好的对接活性，其中对接活性最好的为槲皮素与MAPK1，见图6。其次是山奈酚与AKT1，见图7。

图6 槲皮素与MAPK1 分子对接图Fig 6 Docking diagram of quercetin and MAPK1

图7 山奈酚与AKT1 分子对接图Fig 7 Docking diagram of kaempferol and AKT1

3 讨论

玉屏风散作为临床常用经典方剂，合用黄芪与白术，以求补脾益肺，培土生金，建运中焦脾胃使气血生化有源；少量防风祛散风邪，补中兼疏，固表而不留邪，发挥扶正益气、固表止汗功效。现代药理学研究表明玉屏风散具有提高机体免疫力，抗肿瘤功效［20］。通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，减缓肿瘤细胞转移等方式发挥抗肿瘤作用，体现了中医“扶正祛邪，标本兼治”的治疗思想［21］。同时有临床研究证实，玉屏风颗粒可以有效地降低NSCLC 放化疗所造成的骨髓抑制、消化道反应等不良反应，增强放化疗敏感性，有效改善患者生存质量［22］。但目前由于中药复方成分复杂，具有“多成分、多靶点、低亲和力、低选择性”的特点，对于不同药物之间的相互作用以及不同剂量所带来的影响需进一步验证。网络药理学将疾病-基因-靶点-药物之间的复杂关系运用专业的可视化网络分析软件，以网络信号的形式表现出来，通过研究多途径调节信号通路，来阐述并探索如何有效提高药物疗效，更贴合复方中药的研究思路［23］。

网络分析显示玉屏风散治疗非小细胞肺癌度排名前三的化合物为槲皮素、山奈酚、汉黄芩素。以往有诸多研究表明槲皮素具有良好的抗肿瘤活性，主要机制涉及诱导细胞凋亡，通过抑制如Bcl-xL 和Bcl-2 抗凋亡蛋白，调节细胞凋亡的细胞信号蛋白，上调促凋亡蛋白；抑制细胞增殖，阻滞细胞周期从G0/G1向G2/M 进展；抑制血管生成和转移等［24］。有研究表明槲皮素通过下调MMP-9 和TGF-β1的表达，从而促进A549 细胞凋亡［25］。Lee等［26］通过对比各种浓度的槲皮素和吉西他滨单独或组合治疗肺癌，发现槲皮素联合吉西他滨的治疗可通过下调热休克蛋白70（HSP70）起到化学增敏作用。但目前水溶性差和生物利用度低限制了进一步临床使用［27］。研究发现山奈酚具有良好的抗癌活性［28］，可通过抑制抑制AKT-1 介导的Smad3残基的磷酸化从而抑制非小细胞肺癌的转移，山奈酚抑制肿瘤细胞黏附、迁移及侵袭的能力是其发挥抗癌功用的一种方式。埃兹（ezrin）蛋白是一种细胞膜与细胞骨架之间的连接蛋白，可促进肿瘤增殖、侵袭与转移。研究表明，汉黄芩素能够通过下调此类蛋白表达和磷酸化活性，从而减少肿瘤细胞增殖、侵袭［29］。同时，高源等［30］通过加入IL-6 促进A549 细胞发生侵袭转移，并在此基础上加入了不同浓度汉黄芩素，结果显示，在不影响A549 细胞增殖的给药浓度下，汉黄芩素能够有效抑制侵袭转移，且呈剂量依赖性。

根据核心靶点属性参数可知玉屏风散主要通过MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、AKT1（蛋白激酶）、TP53（肿瘤坏死蛋白53）、JUN（转录因子AP-1）、TNF（肿瘤坏死因子）等靶点治疗NSCLC。其中MAPK1 为MAP 激酶家族的一个成员，作为生物体内重要的信号转导通路，主要参与多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控和发育。有多项研究表明MAPK1/ERK 信号通路激活可导致癌症的发生发展，其与结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等多种癌症密切相关［31-33］。同时有研究证实在NSCLC 组织中MAPK1 的表达量高于正常肺组织，为NSCLC 的诊断提供一定的参考价值［34］。AKT 即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K 下游的关键信号，主要通过对一系列底物的磷酸化，起到细胞生长和增殖、促进细胞运动、诱导细胞凋亡等作用［35］。而AKT1 作为AKT 的重要亚型之一，与多种癌症发病密切相关［36］。研究证实AKT1 在NSCLC 中表达较高，在其发生过程中起促癌作用，且AKT1 蛋白的表达表达越高提示肺癌分化程度越低、恶性程度越高，往往与淋巴结转移以及TNM 分期等密切相关［37］。TP53，又称p53 基因，将近50%的NSCLC 中存在该基因突变［38］。P53 可通过诱导细胞凋亡，阻止癌细胞生成，在细胞生长、分化和调控凋亡方面起着关键作用。有研究证实接受同样的化疗方案，携带TP53 基因突变的患者较野生型NSCLC 患者OS 较短，提示TP53 突变是NSCLC 预后不良的预测因素［39］。突变的TP53 可使野生型TP53 的抑癌功能丧失，并且可促进癌症进展或耐药基因的异常上调，故有研究认为重建TP53 介导的肿瘤细胞通路，可为治疗肿瘤提供新的肿瘤细胞特异性治疗策略［40］。TNF 参与多种生物学过程，涉及到细胞的分化、增殖、凋亡。其对肿瘤具有双向作用，可以通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促进基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）的表达，刺激肿瘤血管生成，而同时在诱导凋亡、增强免疫力和促进T 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用方面产生抗肿瘤效应［41］。JUN可以减少细胞凋亡，防止TNF-α 诱导的凋亡，同时有研究证实JUN 参与非小细胞肺癌肿瘤的形成，同时促进了肿瘤的转移［42］。

核心靶点GO 富集分析显示，生物过程中因子介导的信号通路与肿瘤的发生发展密切相关［43］，细胞成分中的血小板α 颗粒管腔与血小板α 颗粒在促进肿瘤血管生成中起到重要作用［44］，而分子功能多涉及细胞增殖过程以及核受体的活动等。KEGG富集分析显示，玉屏风散治疗NSCLC 涉及多种信号通路，包含了多种与肿瘤明确相关的信号通路。如IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway），TNF信号通路（TNF signaling pathway），MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、癌症相关信号通路（Pathways in cancer）。IL-17 信号通路的激活与NSCLC 发生发展密切相关，有研究证实白细胞介素（IL-17）在NSCLC 患者肿瘤组织中高表达，不仅导致肺病免疫抑制，增强肿瘤血管的生成，同时促进肿瘤的侵袭转移［45］。TNF 信号通路的失调可以引起肿瘤，炎症等多种疾病，其中TNF-α 激活JNK和转录因子NF-κB 等信号通路，起到细胞凋亡，免疫调节等作用［46］。同时TNF-α 作为重要炎症介质之一，在肿瘤的淋巴转移中起到重要作用，有研究表明黄芪可通过TNF 信号通路阻滞其诱导生成其他炎症介质从而抗肿瘤淋巴转移的作用［47］。MAPK 信号通路在肺癌发生、发展中起到关键作用，其主要有p38 MAPK 途径、ERK1/2 途径和JNK途径ERK4/BMK1 四条途径。这几种MAPK 途径参与的信号转导通路司职不同的功能，其中p38 MAPK 途径在调控细胞周期、细胞分化、细胞凋亡、细胞自噬等方面影响着肿瘤的发生和发展［48，49］。有研究证实抑制血清淀粉样蛋白A 可降低人肺癌细胞株A549 体外增殖、迁移、侵袭活性，而其主要作用便是通过抑制MAPK 通路磷酸化实现［50］。有诸多研究表明Toll 样受体信号通路于肺癌密切相关［51-53］，Toll 样受体（TLR）表达于多种免疫细胞，兼有促肿瘤及抗肿瘤作用，可以引起肿瘤细胞凋亡，产生抗肿瘤免疫反应。TLRs 表达的上调促进了肿瘤的生长，TLRs 诱导的信号通路最终会激活NF-KB 与MAPKs 信号通路，释放的大量炎性因子，构建适宜肿瘤生长的肿瘤微环境的形成，同时诱导细胞增殖和转化，抑制细胞凋亡。

综上，本文通过网络药理学，筛选出玉屏风散中的主要活性成分，并构建活性成分-疾病靶点之间的协同作用关系。实现活性成分与机体内相应靶点的对接，并得出了玉屏风散治疗NSCLC 潜在的作用靶点及相关通路，分子对接结果显示相关化合物与核心靶点具有良好的对接活性，并推测槲皮素-MAPK1、山奈酚-AKT1 在治疗中发挥重要作用，为后续试验和临床应用提供重要理论依据。然而本研究的数据主要从数据库收录获得，无法兼顾临床中药剂量、煎煮条件等因素所带来的影响，具有一定局限性，故具体结果仍需进一步实验验证。