枯草芽孢杆菌复合微生态制剂对鸡坏死性肠炎回肠黏膜损伤的预防作用

郑梦琳，朱阳华，赵慧玲，王柏森，高艳梅，谢长清*

(1.华中农业大学 动物医学学院 动物病理学实验室，湖北 武汉 430070；2.武汉新联大生物有限公司，湖北 咸宁 437222)

鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)是由产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，CP)引起的一种以回肠组织病变为主的肠道疾病。目前，在全世界范围内，肉鸡NE已经成为影响养禽业生产发展的重要因素。自2006年以来，随着抗生素耐药菌株的出现以及对人类的传播，欧盟禁止抗生素进入动物养殖中；2020年7月，我国也出台相关政策禁止饲料中使用抗生素生长促进剂，使得肉鸡NE的防治问题变得更加突出。因此，寻找非抗生素替代品来控制该病已成为养禽业非常关注的问题。有关研究表明，疫苗、噬菌体、益生菌、酸化剂、卵黄抗体、植物精油和植物提取物等是有效的替抗产品[1-2]。目前国内关于预防NE的抗生素替代物研究主要集中在微生态制剂及疫苗的研究，研究表明饲料中添加枯草芽胞杆菌PB6可显著提高肉鸡成活率和减轻CP的感染程度[3]；添加地衣芽孢杆菌H2能提高肉鸡生长性能和调节由NE导致的菌群失调[4]；添加约氏乳杆菌BS15可提高小肠消化吸收能力、肠道免疫水平以及抗氧化能力，从而预防由CP引起的亚临床NE[5]。以上研究均证明微生态制剂能够成为预防NE的抗生素替代物。本试验选取由武汉新联大生物有限公司研发的以枯草芽孢杆菌为主的微生态制剂1以及枯草芽孢杆菌低温发酵产物为主的微生态制剂2，利用CP感染肉鸡建立NE模型，研究日粮添加对感染CP肉鸡的回肠黏膜损伤的预防作用，为其在实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂1日龄健康817雏鸡60只，购自襄阳正大农牧有限公司;基础日粮选购510肉小鸡正大饲料;产气荚膜梭菌(CP-0/CP-7)由华中农业大学基础兽医病理实验室分离鉴定保存，临用前用FTG(液体硫乙醇酸盐培养基)增菌培养至108CFU/mL;微生态制剂由武汉新联大生物有限公司提供，其中微生态制剂1主要成分：枯草芽胞杆菌、酵母、香芹酚、百里香酚、肉桂醛等;微生态制剂2主要成分：枯草芽胞杆菌及其低温发酵产物;总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1 法)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(ABTS法)购自南京建成生物研究所;CHICKEN IGA ELISA，sIgA购自美国Bethyl laboratories Inc公司。

1.2 动物模型构建动物试验遵循《湖北省实验动物管理条例》中的规定，雏鸡入舍前洗净料盘和饮水器，用福尔马林和高锰酸钾熏蒸鸡舍24 h后通风1周。试验鸡采用笼养，日粮中添加6%甘氨酸，自由采食和饮水。将60只1日龄健康817雏鸡随机分为4组，分别为对照组(Control组),微生态制剂1组(MEA 1组),微生态制剂2组(MEA 2组),坏死性肠炎感染组(NE组)，具体分组见表1。于14日龄开始攻菌(2 mL新鲜菌液灌胃)，连续攻菌后3 d处死。对肉仔鸡回肠组织进行取样。将回肠组织于4%甲醛中固定，用于组织病理学观察和绒毛长度/隐窝深度比分析；同时取回肠组织10 cm，用生理盐水冲洗肠内容物后刮取其黏膜-20℃冰箱保存，用于检测回肠黏膜的抗氧化水平和sIgA含量；同时取回肠约2 cm，-80℃冰箱保存，用于检测紧密连接蛋白mRNA表达量。

1.3 回肠组织病理学观察和绒毛长度/隐窝深度比分析将4%甲醛溶液固定好的回肠组织制成常规石蜡切片，厚3 μm,采用HE染色法观察回肠组织的病理变化。采用Nikon 80i生物光学显微镜及高清晰度彩色图文分析系统对每张组织切片选取测量结构完整的5根绒毛长度(villus length，VL)和5个隐窝深度(crypt depth，CD)，进行VL/CD检测分析。

表1 试验分组

1.4 回肠黏蛋白面积率测定将上述制备好的石蜡切片经六胺银染色法，采用Nikon 80i生物光学显微镜及Image J图像处理软件对阳性信号进行灰度分析，每张切片随机选取5个视野，测量阳性信号面积占所测视野的百分比即黏蛋白(Mucin，MUC)面积率。

1.5 回肠黏膜抗氧化指标检测和sIgA含量测定称取约0.3 g肠黏膜组织按1∶9(W/V)加入PBS缓冲液中，冰浴后匀浆2 min，4℃、1 500 r/min离心10 min，取适量上清液,按照试剂盒内说明书对回肠黏膜的T-SOD活性、T-AOC活性进行检测。同时按照CHICKEN IGA ELISA试剂盒的说明书，对回肠黏膜的sIgA含量进行检测。

1.6 回肠紧密连接蛋白mRNA表达量检测根据TRIzol方法提取上述冻存于-80℃的回肠组织的RNA，使用微量分光光度计检测其纯度合格后，反转录为cDNA，分装后的cDNA置于-20℃保存。参照文献[6]合成PCR引物(表2)。以Real-time PCR检测空肠细胞紧密连接蛋白闭合蛋白(claudin，CLDN)-1、闭合小环蛋白(zonula occludens，ZO)-1和ZO-2基因的mRNA表达情况。扩增体系：cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL，2×chamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 4.5 μL。加完体系后瞬时离心，反应程序为 95℃预变性 5 min；进入循环，95℃ 5 s，56℃ 45 s，共40个循环；95℃ 15 s，溶解曲线从 65℃升高到 95℃，每5 s升高 0.5℃。

表2 Real-time PCR引物序列表

2 结果

2.1 回肠组织病理学观察回肠HE染色观察结果如图1所示，Control组(图1A)回肠绒毛完整，排列整齐；MEA 1组(图1B)与MEA 2组(图1C)与Control组无显著性差异；NE组(图1D)回肠绒毛显著缩短，固有层增厚且炎性细胞浸润，黏膜上皮异染，坏死脱落。

A.Control组；B.MEA 1组；C.MEA 2组；D.NE组

2.2 不同处理组回肠绒毛长度/隐窝深度差异如表3所示，NE组回肠绒毛长度显著低于Control组，隐窝深度显著高于Control组(P<0.05)，MEA 1组、MEA 2组VL/CD比值显著高于NE组(P<0.05)，与Control组无显著性差异(P>0.05)。

表3 肉仔鸡回肠VL/CD分析 μm

2.3 不同处理组回肠黏蛋白含量差异肉仔鸡回肠黏蛋白的面积率测定结果如图2所示，MEA 1组、MEA 2组黏蛋白面积率显著低于NE组(P<0.05)，与Control组相比无显著性差异(P>0.05)。

图2 回肠黏蛋白面积率测定

2.4 回肠黏膜抗氧化指标检测如图3A所示，NE组T-SOD活力显著低于Control组(P<0.05)，MEA 1组T-SOD活力与NE组相比无显著性差异(P>0.05)，MEA 2组T-SOD活力略高于NE组，略低于Control组，但差异均不显著(P>0.05)；如图3B所示，NE组T-AOC活力显著低于Control组(P<0.05)，MEA 1组T-AOC活力略高于NE组，略低于Control组，但差异均不显著(P>0.05)，MEA 2组T-AOC活力显著高于NE组(P<0.05)，与Control组相比无显著性差异(P>0.05)。

图3 回肠黏膜抗氧化指标检测

2.5 不同处理组回肠黏膜sIgA含量差异不同处理组回肠黏膜sIgA含量如图4所示，MEA 1组略低于Control组、MEA 2组略高于Control组，3组之间没有统计学差异(P>0.05)，而3组的sIgA含量均显著低于NE组(P<0.05)。

图4 回肠黏膜sIgA含量测定

2.6 不同处理组回肠紧密连接蛋白mRNA表达量差异如表4所示，MEA 1组、MEA 2组回肠黏膜紧密连接蛋白CLDN-1、ZO-1的mRNA表达量显著高于NE组，与Control组无显著性差异；NE组回肠黏膜紧密连接蛋白ZO-2的mRNA表达量显著低于Control组，MEA 1组、MEA 2组紧密连接蛋白ZO-2的mRNA表达量显著高于NE组和Control组。

表4 回肠紧密连接蛋白mRNA表达量测定 μm

3 讨论

目前，随着我国饲料抗生素的禁用，寻找一种安全有效的抗生素替代品成为家禽养殖备受关注的话题之一。近年来，微生态制剂经常作为一种理想的替抗产品广泛应用于肉鸡养殖中，用以减少肠道疾病的发生率[7]。目前,我国的研究主要集中在枯草芽孢杆菌等单一益生菌对鸡坏死性肠炎(NE)的预防作用，而对于复合微生态制剂的研究较少。在本试验中，微生态制剂1除含有枯草芽孢杆菌外还添加了酵母、香芹酚、百里香酚和肉桂醛等成分。酵母能显著提高畜禽的消化吸收能力，调节肠道菌群，增强机体免疫力，可作为一种绿色添加剂用于畜禽养殖中[8]；香芹酚、百里香酚和肉桂醛等植物精油对产气荚膜梭菌具有抗菌活性，可提高肉鸡生长性能和胴体品质[9-12]；微生态制剂2主要成分为枯草芽孢杆菌及其低温发酵产物，与传统发酵技术相比，低温发酵具有发酵过程缓慢、代谢反应完全、脂类和风味物质形成丰富的特点，目前广泛应用于果酒和沼气的发酵[13]。张秀玉等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌在26℃低温发酵情况下可以产生具有较高抑菌活性的蛋白；叶云峰等[15]研究发现,在低温发酵环境有利于枯草芽孢杆菌菌体含量的增加。因此，本试验选用这2种以枯草芽孢杆菌为主复合微生态制剂，证实其对NE回肠黏膜损伤具有预防作用。

2种复合微生态制剂能够显著缓解NE所致的回肠黏膜形态结构改变，维持回肠黏膜完整性。临床上绒毛长度/隐窝(VL/CD)深度比是衡量肠道组织消化和吸收能力的重要指标，绒毛长度反映小肠吸收物质的速率和程度，隐窝深度反映小肠上皮细胞生成率[16]。因此，VL/CD值越大，说明小肠上皮细胞成熟率越高、肠绒毛功能越强、肠黏膜消化吸收营养物质的面积也越大，更有利于肉鸡的生长和生产。相反，VL/CD值越小说明小肠消化吸收能力越弱，生长更加缓慢，对疾病的抵抗力也就随之降低。本试验中NE组绒毛长度显著缩短，VL/CD值显著低于对照组，微生态制剂组有所缓解，与组织病理学观察结果一致。益生菌复合制剂能促进肉鸭肠道组织黏膜发育，使绒毛长度增加，隐窝深度降低，VL/CD值显著增加[17]，与本试验结果一致。紧密连接(tight junctions,TJs)是由跨膜蛋白组成的多蛋白复合物[18]，通过细胞质蛋白与肌动蛋白的细胞骨架相连，将同一组织的细胞固定在一起，可以维持细胞之间联系。claudin-1、ZO-1和ZO-2的表达在肠道上皮，许多肠道致病菌诱发的肠道病变与紧密连接的破坏有关，包括肠致病性大肠杆菌(EPEC)、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲杆菌、结膜弯曲杆菌和沙门氏菌[19]。本试验研究发现，NE组紧密连接蛋白基因claudin-1、ZO-1和ZO-2表达量下降而微生态制剂的加入提高了其表达量，表明微生态制剂促进了上皮细胞之间的紧密连接，进而维持回肠黏膜的完整性，这与VL/CD检测分析结果一致，并与DU等[20]报道的结果一致。

2种复合微生态制剂能够减轻产气荚膜梭菌(CP)对回肠黏膜的刺激，缓解回肠黏膜炎症反应，提高回肠黏膜抗氧化水平。黏蛋白是一类由黏多糖组成的糖蛋白，主要由杯状细胞产生并分泌[21]。黏蛋白与水结合形成黏液，位于黏膜表面，参与构成黏膜抵御外来病原微生物入侵的第一道屏障，具有润滑和保护肠道的作用。因此，黏蛋白是衡量肠道组织健康状况的重要指标。在黏蛋白面积率测定试验中，NE组的黏蛋白含量显著高于Control组，MEA 1组和MEA 2组回肠黏蛋白的含量与NE组相比显著降低。有研究指出枯草芽孢杆菌生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等活性物质，这些活性物质对致病菌或某些内源性感染的条件性致病菌有明显的抑制作用[22]。因此，本试验中的微生态制剂可能通过抑制CP的生长繁殖，减轻了该菌对回肠黏膜的刺激，进而缓解回肠黏膜损伤.自由基在生物体内参与吞噬病原体、调节细胞增殖与分化、参与前列腺素和凝血酶原的合成等生理功能[23]。抗氧化物SOD属于酶促自由基清除系统，SOD活性降低与自由基水平升高有一定的相关性[24]。本试验发现，CP感染可引起回肠肠道内SOD和AOC活力显著降低,表明CP感染可促进肠道自由基的产生从而介导炎症的发生。MEA 1组和MEA 2组在感染CP后肠道内SOD活力和AOC与Control组相比没有显著性差异。研究发现，约翰逊乳杆菌通过显着增加T-AOC、SOD水平，对抗氧化能力表现出积极的影响[25]，与本试验结果基本一致，表明在日粮中添加微生态制剂可能通过提高肉鸡的抗氧化能力而缓解因CP感染所造成的氧化应激，减轻回肠黏膜的炎症反应。分泌型sIgA是机体特异性免疫的重要组成之一，参与局部黏膜免疫。适当水平的sIgA可以调节肠道内细菌生长，不引起免疫细胞的过度分化与增殖[26-27]。研究表明，感染CP可以上调IL-4等炎性细胞因子的表达[28]，提高家禽肠道炎症免疫反应水平[29]；下调感染细胞中的炎性细胞因子IL-6的mRNA表达[30]，证明了益生菌能抑制CP引起的炎症反应。本试验中，NE组sIgA水平显著高于Control组，而MEA 1组和MEA 2组显著缓解了这一现象，造成这种结果可能与回肠黏膜炎症反应减轻有关，具体机制有待进一步研究。