pAPN和NEU3的敲除对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的影响

李兆龙，丰志华，张冰晨，方 舟，梁旺旺，陈文志

(1.福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建师范大学 南方生物医学研究中心，福建 福州 350013)

猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是猪传染性胃肠炎的病原，不同种类和不同日龄猪都呈现易感性。以往该病主要在冬季较为常见[1]。但近几年，随着养殖密度和规模增加，呈现一年四季皆有发病。它主要临床症状为呕吐、脱水和严重腹泻等。而中大猪和成年母猪感染后病死率低，但哺乳仔猪感染后发病率和病死率可达100%，是我国当前生猪养殖中的一种固疾，给畜牧业生产带来巨大的损失。为了进一步加强该病的防控，有必要深入研究TGEV的感染机制，为药物和疫苗开发，或抗病品种研发奠定基础[2]。之前研究报道，氨基肽酶(pAPN)是TGEV侵染的主要受体，猪体内的pAPN敲除后，明显抑制TGEV的侵染，减少TGEV的发病率[3-5]。但是，TGEV的侵染方式多样，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染[6]。此外，唾液酸神经氨酸酶(NEU3)作为病毒侵染的另一个重要中间体，发挥重要的作用[10-11]。病毒的侵染是一个复杂系统，详细的作用机理尚待进一步揭示。pAPN和NEU3共同敲除是否能更好地抑制该病毒的入侵，尚待进一步的研究。

本试验旨在运用CRISPR基因敲除技术，对ST细胞中的pAPN和NEU3双基因共同敲除，以评估它对TGEV的入侵影响，从而推动相关疫苗和抗TGEV品种猪的研究。

1 材料与方法

1.1 试验细胞、细菌和质粒ST细胞购上海英杰生物科技有限公司；pX459购自美国Addagen公司。

1.2 试剂本试验所用试剂及来源见表1。

表1 试剂及来源

1.3 引物及sgRNA为了敲除ST细胞中的pAPN和NEU3基因，参照sgRNA设计网站:https://zlab.bio/guide-design-resources进行双基因的sgRNA设计,并送测序公司合成。

1.4 试验设计见图1。本研究设计了针对pAPN 和NEU3两个关键基因CRISPR基因编辑系统，通过脂质体转染ST细胞，培养24 h后，用嘌呤霉素进行筛选，然后挑取单克隆细胞，测序验证。再将TGEV感染pAPN 和NEU3两个关键基因敲除的ST细胞，观察对细胞病变的改善、TGEV滴度的影响、干扰素的mRNA水平变化等指标，以评估它对TGEV侵染的影响。

1.5 重组编辑两目标基因载体的构建本研究中使用的sgRNA是在sgRNA Designer:CRISPRko (broadinstitute.org)网站上设计，针对pAPN 和NEU3两个关键基因设计多个sgRNA(表2)，由福州铂尚生物科技公司合成，合成后的sgRNA退火，与酶切的Px459编辑质粒按相关体系组成进行连接，见表3。连接后转化至感受态细菌DH5a，然后挑取单克隆菌，进行PCR扩增并提DNA，将扩增出来的产物送福州铂尚生物科技公司测序验证。sgRNA退火体系：10×PCR 缓冲液2.5 μL，F-sgRNA 1 μL，R-sgRNA 1 μL，双蒸水20.5 μL， 共计25 μL。

表2 sgRNA名称及序列

表3 验证引物

将sgRNA的各组分依次加入后混匀，再低速离心20 s。将各反应物放置反应管进行反应，反应条件如下：初始温度 95℃，进行10 min；然后进行梯度温度处理：按95℃～85℃，2.5℃/s；85℃～25℃，0.25℃/s；25℃ 5 min。反应结束后取3 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测验证。双酶切体系:质粒(1 μg)，10×Fast 缓冲液2 μL，快消化酶-F 1 μL，快消化酶-F-R 1 μL，双蒸水补足25 μL，总计25 μL。

将质粒所需各组分，按上表安排，依次加入后低速离心混匀20 s，后37℃维持15 min，取3 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测验证。连接反应体系:10×T4DNA缓冲液2.5 μL， sgRNA2质粒70 ng， T4DNA 连接酶1 μL，双蒸水补足25 μL，总计25 μL。

按连接试剂盒的说明进行常规的连接，再将连接产物转化到50 μL感受态细胞，于 37℃培养1 h，再3 000 r/min离心，再用20 μL重悬液，后均匀涂至含AMP的LB平板，置37℃倒置培养过夜。18 h后，挑取单克隆并加入2 mL LB，进行扩增培养14 h。然后吸取单克隆菌液300 μL 送至福州铂尚测序公司测序验证，将测序结果使用bioedit软件进行比对分析验证。

1.6 构建pAPN 和NEU3两个关键基因敲除ST细胞

1.6.1构建 将构建成功的重组编辑质粒Px459-pAPN和Px459-NEU3，按1∶2的比例加入脂质体LIPO2000，混匀并加入20 μL体积的无血清培养基。待6孔板ST细胞长至汇合度70%时，用无血清培养基清洗2次，然后加入转染混合液，37℃培养18 h。去除转染混合液，加入正常的血清培养液，并按100 mg/L加入嘌呤霉素进行筛选；4～7 d后，去除含嘌呤霉素的培养液，加入新鲜DMEM培养基，培养大概12 h后，放置显微镜观察，可见微小单克隆细胞群落，然后在镜下挑取单个克隆，放置新的培养皿，加入新的培养基进行扩大培养。扩大培养后收取克隆细胞，提取总DNA进行pAPN-/-和NEU3-/-双基因敲除PCR验证。然后利用Western blot在蛋白水平上验证pAPN-/-和NEU3-/-双基因敲除细胞株。

1.6.2PCR及Western blot验证 为了进一步验证单克隆细胞株是否成功敲除pAPN和NEU3双基因，我们设计了2对引物，进行PCR验证，引物序列如表3。细胞基因组DNA的提取见常规DNA提取试验盒操作(略)。PCR验证反应体系：5×PCR反应混合液(Mix)25 μL，模板5 μL，双蒸水20 μL。反应条件：42℃ 2 min，4℃保存。免疫印迹试验:配置10%的分离胶，并加入到制胶板底层，为了去除分离胶内的气泡并保持分离胶的平行，在加完分离胶前加入水压平放置15 min。用滤纸将分离胶上层的水吸干净，再缓缓加入5%的浓缩胶，并插入加样梳，放置40 min；接着轻缓拔除凝胶上的梳子，再重新把胶板放入电泳槽，添加一定比例的电泳缓冲液，当缓冲液没过长玻璃板后，停止添加。待液面静止5 min，用加样器往凝胶上样孔加入蛋白样品。然后打开电泳仪电源，设置恒压80 V 持续20 min，后调整电压至120 V持续约100 min；关闭电源，废弃上层的浓缩胶，再用刀片将含有目的蛋白和内参蛋白的凝胶切下放置4℃冰箱保存及待用。接着再根据本次凝胶大小来裁剪滤纸和PVDF膜，将胶、PVDF膜和滤纸浸入转膜缓冲液10～20 min后，先铺好3层滤纸，用玻璃管除去气泡，将胶水涂在去除气泡的滤纸上，然后将PVDF膜覆盖在胶水上，轻轻去除气泡，将靠近胶水的一侧指向黑板，靠近薄膜的一侧与白板对齐。组装改进的薄膜装置，再安装一个改进的膜，300 mA恒定电流至50 min；电转后，取膜，冲洗靠近胶水的一侧，用TBST(5×TBS稀释0.05%吐温-20)冲洗3次。封闭反应：室温下(25℃)，用10%脱脂奶粉或5%BSA封闭PVDF膜1 h。抗原抗体反应：蛋白一抗按抗体规格比例加入，4℃摇床过夜孵育。 第2天，取出PVDF膜，用TBST冲洗3次，每次10 min，然后加入相应的荧光标记二抗，室温孵育2 h，再用TBST冲洗PVDF膜，每次10 min；每片扫描膜用双色红外激光成像仪观察(Odysey)，CorelDRAW12软件分析绘图。

1.7 TGEV感染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞分别取1.1×106个/mL ST细胞和pAPN和NEU3双基因敲除的ST细胞，分别放置4个6孔板，过夜培养。待细胞贴壁完成后，加入1.1×105TCID50/mL的TGEV，并分别于3，6,12,24,36，48 h在显微镜下观察并拍照记录细胞的病变情况。同时收集一孔细胞，提取细胞中的病毒RNA和细胞中干扰素的mRNA，然后实时定量验证TGEV的拷贝数变化、干扰素的mRNA水平及TGEV的纤连蛋白mRNA水平。RNA提取过程如下：按10 cm2/mL 比例加入Trizol，对培养贴壁的两种ST细胞进行消化、裂解，转移至离心管于室温放置5 min，使其充分裂解；Trizol和氯仿按1∶0.2比例添加，温和地混匀，再室温(25℃)放置15 min；然后在4℃离心机中按转速 12 000 r/min离心15 min；取出离心管，小心地吸取上层液体，将其转移至另一根干净的离心管中；再按1∶0.5的比例(Trizol∶异丙醇)加入异丙醇,上下轻轻摇混匀，室温25℃放置5～10 min； 再经4℃ 12 000 r/min转速离心10 min，小心弃上清,以1∶1 加入75%乙醇，温和地温匀；4℃ 8 000 r/min离心5 min，弃上清,室温干燥5～10 min.

1.8 Real-time PCR相对定量法检测基因的表达情况要求各引物的扩增效率在90%～110%之间，各个引物的扩增效率相差不超过5%。用不同引物对模板进行PCR，将PCR产物纯化后导入T载体。然后以108拷贝为起始浓度，依次10倍稀释5个梯度，摸索出最佳PCR扩增条件，再对样本进行相对定量。Real-time PCR反应系列：SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) ROX Plus 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，mRNA溶液(30 mg/L) 3 μL，双蒸水ddH2O 7.2 μL，总计20 μL。反应条件： 95℃ 30 s；95℃ 5 s,55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。熔解曲线阶段：95℃ 15 s，72～88℃，每个周期0.1℃递增。所用实时荧光PCR引物见表4。

表4 实时定量PCR引物

2 结果

2.1 pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞挑取经嘌呤霉素筛选的pAPN 和NEU3双基因敲除ST单克隆细胞，提取细胞的基因组，进行PCR验证，结果产生预期的2个条带，分别为2 881，1 349 bp，与预期的引物结果一致(图2)。然后将该PCR产物测序，结果证实分别在pAPN 和NEU3的245和227 bp 位置出现碱基缺失。用pAPN 和NEU3的双抗，进行Western blot验证，野生型细胞完全能孵出预期的条带，但敲除株的ST细胞在预定位置并没有明显的条带。结果证实pAPN 和NEU3双基因在ST细胞中成功敲除，该基因的蛋白表达或受到抑制，或结构遭破坏。

由图2可知，在单克隆细胞中，吸取200 μL提取基因组DNA，然后进行PCR反应，结果在2 881和1 349 bp位置出现了条带，证明筛选得到了双基因敲除的细胞株。

M.DL5000 DNA Marker；1,2.阴性克隆；3,4.阳性克隆

由图3可知，将 2 881，1 349 bp位置出现的条带测序，结果证实245，227 bp位置出现碱基缺失。

图3 pAPN 和 NEU3双基因敲除测序结果

由图4可知， 取245，227 bp位置出现碱基缺失的ST细胞，进行蛋白免疫印迹试验，敲除株的ST细胞pAPN蛋白表达明显减弱，而NEU3完全看不到。

图4 pAPN和NEU3的敲除及免疫印迹印证

2.2 TGEV感染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞对细胞的影响将1.1×105TCID50/mL的TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除的ST细胞和野生型ST细胞，6 h后，野生型ST细胞出现部分细胞病变，感染TGEV 12 h，野生型细胞出现明显的细胞聚集和死亡的细胞病变，24，36 h后，野生型细胞的聚集、拉网和死亡的细胞病变现象比双基因敲除的ST细胞更为明显(图5)

图5 TGEV感染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞和野生型ST细胞

2.3 TGEV感染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞明显下调了干扰素和纤连蛋白的产生Beta干扰素是机体产生的一类糖蛋白，它具有高度的种属特异性。当机体感染病毒时，会产生大量的干扰素来抵制病毒的增殖。因此，在本试验中，通过干扰素的mRNA水平，间接地反映初期病毒的强弱，当前期感染病毒较强，激发机体的免疫反应就大，产生的Beta干扰素水平就较高。pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞，产生的干扰素水平远低于野生型细胞，这个结果间接说明敲除细胞内的病毒量可能低于野生型细胞(图6)。

图6 干扰素mRNA

实时定量PCR检测，TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞，产生的Beta干扰素mRNA远低于野生型细胞，差异极显著(*P<0.05， ***P<0.001)。

TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒直径为90～200 nm，它的主要结构蛋白是纤突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。因此，我们将细胞中TGEV的纤突(S)蛋白的mRNA作为TGEV侵染细胞的标志。结果表明，野生型细胞感染TGEV后，细胞中病毒的S蛋白的mRNA在108，而pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞S蛋白的mRNA还不足102，远低于野生型细胞，差异极显著。结果表明pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞可能抑制了病毒的入侵(图7)。

图7 TGEV的S蛋白的mRNA

实时定量PCR检测，TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞，产生的S蛋白mRNA远低于野生型细胞，差异极显著(*P<0.05， ***P<0.001 )。

2.4 不同滴度的TGEV感染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞为进一步验证pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞可以抑制TGEV的入侵，用不同滴度的TGEV侵染pAPN 和NEU3双基因敲除ST细胞，结果发现和对照组细胞相比，在2.2×104，4.4×104，4.4×105，8.8×105TCID50/mL的细胞病变明显较轻，并且随着滴度增加，敲除细胞并没有明显的变化。而对照组细胞，随着滴度上升，细胞病变更为明显(图8)。

图8 不同滴度的TGEV感染pANA和NEU3敲除ST细胞和野生型细胞

3 讨论

有研究证实，pAPN是TGEV侵染机体的主要受体，将猪体内的pAPN敲除，会明显抑制TGEV的侵染，减少TGEV的发病率[7-10]。但是，TGEV的侵染方式多样，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染。NEU3作为病毒侵染的另一个重要中间体，发挥了重要的作用[10-11]。本研究结果证实，将pAPN和 NEU3双敲的ST细胞，不管是病毒主要结构蛋白，还是病毒感染引起的Beta干扰素的水平，都明显比对照野生型低，细胞的病变也不明显。此外，我们用不同滴度的TGEV侵染双基因敲除细胞，结果发现，它的细胞病变并不随着感染滴度的增加而变化。此结果从另一个层面说明，pAPN和NEU3双敲，对TGEV的侵染有更为明显的抑制，但对病毒滴度的变化，还有待进一步研究。

本研究中，将纤突蛋白作为病毒在体内滴度变化的主要指征，主要基于TGEV主要结构蛋白是纤突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白[12]。其中，以S蛋白尤为重要，也常作为病毒变异或毒力变化的指征[13]。

这个在人的冠状病毒中，尤为多见。近来发生的新冠病毒，大多以S蛋白作为研究的核心，不管是从检测还是疫苗的研究等。因此，在本研究将S蛋白的mRNA作为TGEV侵染细胞的标志。从细胞病变以及Beta干扰素的结果也证实，S蛋白作为病毒在体内滴度变化的主要指征，是能正确反映病毒侵染细胞的情况。

此外，我们将Beta干扰素作为病毒侵染细胞初期情况的其中一个指征，也是基于大部分病毒侵染机体或细胞，都会激起机体强烈的免疫反应，产生大量的Beta干扰素[14]。病毒滴度越高或毒力越强，产生的Beta干扰素量就越大。因此，它在一定程度，反映了病毒侵染细胞的强弱和病毒滴度的高低。但它并不能替代病毒的滴度测定，它只能间接反映病毒的入侵情况。

本研究结果显示，pAPN和 NEU3双敲的ST细胞可明显减少TGEV入侵，病毒的拷贝数明显低于对照组，并且病毒滴度的增加对细胞的病变改变不明显；因此pAPN和 NEU3双敲，可为将来抗TGEV猪的选育和抗TGEV的药物筛选提供理论基础。