赵 安,郭长权,周 烁,吴杨杨,张才乔,米玉玲
(浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310058)
转化生长因子β(TGF-β)超家族是卵巢内最重要的卵泡发生调节因子之一,包括BMPs、激活素、抑制素、生长分化因子和抗缪勒氏管激素,其主要功能是调节组织的生长和发育,包括细胞的增殖、分化和凋亡[9-11]。其中,BMP15的研究最为广泛。BMP15在卵母细胞中特异性表达,对原始卵泡的激活和发育起到关键作用。BMP15基因突变的小鼠在卵泡发育的初级阶段受阻最终无法生育[12]。缺乏BMP15的雌性大鼠的排卵率和受精率显著下降[13]。尽管这些研究表明BMP15可能参与卵泡生长和发育的调节,但其在雏鸡卵巢中对原始卵泡发育的影响尚不清楚。
BMP15通过TGF-β家族受体BMPR2和BMPR1B(ALK6)调控颗粒细胞的增殖,对鸡卵泡颗粒细胞具有促分化作用[14]。BMP15在颗粒细胞表面与BMP受体1B(BMPRIB/ALK-6)或BMP受体(BMPRII)复合物结合[15]后,激活细胞内Smad1/5/8信号通路。Smad4是常见的协同Smad作用蛋白(co-Smad),参与激活BMP和TGF-β/激活素的信号通路[16]。BMP15以剂量依赖的方式通过细胞内信号通路Smad1/5/8来促进人原始卵泡的激活[17]。此外,已有研究表明,Smad5突变使小鼠原始生殖细胞的数量减少[18]。因此,BMP15可通过Smad1、Smad5和Smad4信号通路激活原始卵泡。
本试验采用雏鸡卵巢组织的体外培养模型和体内注射试验,通过形态学观察以及细胞的增殖和凋亡检测,探索BMP15在鸡早期卵巢中对原始卵泡激活和发育过程中的调节作用,为提升家禽繁殖性能提供理论参考。
1.1 主要试剂及仪器BMP15购自武汉云克隆公司;青霉素-链霉素溶液、DMEM和胎牛血清(FCS)购自Hyclone公司;胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐和溴脱氧嘧啶核苷(BrdU)购自Sigma公司;ML347购自MedChem Express公司;兔抗BMPR1B、兔抗增殖细胞核抗原(PCNA)、兔抗BCL2、兔抗人单克隆抗体(BAX)、兔抗Smad1、兔抗Smad4、兔抗Smad5、兔抗连接蛋白43(CX43)、鼠抗β-actin、HRP-标记山羊抗兔IgG、HRP-标记山羊抗鼠IgG、TRITC或FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗鼠IgG购自华安生物公司;兔抗细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、抗细胞周期蛋白D1(CCND1)、二氨基联苯胺(DAB)、30%丙烯酰胺、TEMED购自博士德公司;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、RIPA、PMSF购自碧云天公司;鼠抗BrdU购自DSHB公司;原位末端转移酶标记(TUNEL)试剂盒、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自南京维诺赞公司;TRIzol购自Invitroge公司;BCA蛋白定量试剂盒购自南京建成公司;PageRulerTMPrestained Protein Ladder购自Thermo公司。
1.2 动物和组织制备海兰蛋鸡受精种蛋(购自杭州市正大肉鸡场)置于温度38.5℃、湿度60%的孵化箱中孵育至出雏。雏鸡在适宜的条件下饲养,所有操作均按照浙江大学《实验动物护理和使用指导原则》(ZJU20170660)进行。将BMP15溶于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中,于出雏后第4天按0.2,1.0,5.0 μg/kg 的剂量连续注射(i.p.)3 d,对照组注射PBS。3 d后将雏鸡处死,取出卵巢用于形态学观察,或冻存于液氮中用于Western blot试验。
1.3 卵巢组织培养将4日龄雏鸡卵巢切成2~3片进行组织培养。将0.45 μm滤膜放入24孔细胞培养板(Corning Inc.,NY,USA),每孔放入2片卵巢组织,加入750 μL的培养液培养3 d。培养液中添加了100 IU/mL青霉素-链霉素、5%FCS、10 mg/L 胰岛素、5 mg/L转铁蛋白和30 nmol/L亚硒酸盐。BMP15的处理剂量分别为20,100,500 μg/L。每24 h更换培养液1次。
1.4 对BMPR1B的抑制作用体外试验中,4日龄雏鸡卵巢组织用10 μmol/L ML347和100 μg/L BMP15单独或联合培养,培养3 d后收集卵巢组织进行形态学分析和生化检测。
大学生学习目标不明确,缺乏学习动力,学习兴趣不高,自控能力差 大学相对宽松自由开放的环境,使得大学生有较多的自主时间,与高中高强度的、目标明确的学习形成鲜明的对比,极易产生放松心态。一些大学生没能形成合理的人生规划,没有确定的学习目标,学习动力不足,学习兴趣不高,面对相对闲暇的时光,加之自控能力差,难免会迷失方向。而手机功能日趋丰富,诱惑力大,导致他们用手机打发时间,并自然而然地在课堂上使用手机。
1.5 免疫组织化学卵巢切片脱蜡浸水后,用3% H2O2溶液在室温下完全覆盖切片20 min,将切片浸没在0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中20 min(98~100℃)修复抗原,PBS漂洗后用山羊血清封闭,室温孵育25 min。此后滴加一抗,包括兔抗BAX(1∶200)、兔抗CDK2(1∶200)、兔抗PCNA(1∶200)和兔抗CCND1(1∶200),切片在4℃下孵育过夜。第2天用PBS洗3次后滴加HRP-标记山羊抗兔IgG,37℃湿盒中孵育1 h。用DAB显色2~10 min,镜检观察,苏木精复染,脱水、透明、封固以及镜检。每组至少采集3个卵巢,每个卵巢最大横截面连续5张切片进行免疫组化,在显微镜(Nikon,Eclipse 80i)下观察拍照。
1.6 免疫荧光染色卵巢切片滴加兔抗BMPR1B或兔抗PCNA(1∶200)后在4℃孵育过夜。第2天切片复温1 h后用PBS洗3次,用FITC或TRITC标记的山羊抗兔IgG作为二抗,37℃孵育1 h,再用DAPI进行复染。连续取各卵巢组织最大横截面5片,采用荧光显微镜观察拍照。
1.7 BrdU检测卵巢组织培养48 h后,在含有10 μg/mL BrdU标记液的培养基中继续培养24 h。切片在鼠抗BrdU作为一抗在4℃孵育过夜后,PBS洗3次。用TRITC标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗孵育1 h,DAPI对切片复染。每组至少采集3个卵巢,连续取各卵巢组织最大横截面5片,采用荧光显微镜观察。
1.8 TUNEL分析步骤按照TUNEL试剂盒说明书操作。每组至少采集3个卵巢,连续取各卵巢组织最大横截面5片,采用荧光显微镜观察。
1.9 透射电镜和细胞超微结构观察卵巢切片在2.5%戊二醛4℃下固定24 h以上,用PBS清洗后置于1%的锇酸溶液固定1.5 h,然后用乙醇和丙酮逐级脱水后包埋剂包埋,70℃高温过夜。使用超微切片机将包埋好的卵巢组织制作厚度为70~90 nm的切片。切片染色后,于Tecnai G2 Spirit型透射电镜(TEM)下观察和拍照。
1.10 RNA提取、逆转录和qRT-PCR用TRIzol从雏鸡卵巢中提取总RNA。按照HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作,反转录获得cDNA。由生工生物工程公司设计引物,引物序列见表1。将cDNA稀释10倍,Real-time PCR反应体系为20 μL。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参,使用比较周期阈值法(2-△△Ct)测定mRNA的相对表达。每组采集3个卵巢。
表1 实时荧光定量PCR引物信息
1.11 Western blot分析卵巢组织用含有1 mmol/L PMSF的RIPA研磨后,按照BCA蛋白检测试剂盒说明书测定总蛋白含量。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30 μL的变性蛋白体系,夹心法(0.22 μm;Micro hole)使蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1 h后,与相应的一抗结合,包括兔抗BMPR1B(1∶200)、兔抗PCNA(1∶500)、兔抗CDK2(1∶500)、兔抗细胞淋巴瘤(1∶500)、兔抗BAX(1∶500)、兔抗Smad1(1∶200)、兔抗Smad4(1∶200)、兔抗Smad5(1∶200)和兔抗CX43(1∶200)。加入HRP标记的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG在摇床上孵育1 h,用ECL显影液显色后采用Quantity One软件进行条带的灰度分析,以β-actin为内参对蛋白进行定量分析。
1.12 数据统计与分析数据均采用形式表示,所得数据采用GraphPad Prism 7.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较进行分析,P<0.05为差异显著。
2.1 BMP15和BMPR1B在雏鸡卵巢中表达的变化从出雏第5~9 天(围绕7 d这一雏鸡原始卵泡大量激活的时间点作为所取材的时间点)的卵巢组织中提取蛋白和RNA。qRT-PCR结果显示,第7天的卵巢组织中BMP15以及BMPR1B mRNA的表达量与第5,6天卵巢组织相比显著提高(P<0.05)(图1A,B)。Western blot结果显示,雏鸡卵巢中BMPR1B蛋白的表达量在第7天显著升高(P<0.05)(图1C,D)。第7天卵巢组织的免疫荧光结果显示,BMP15的受体BMPR1B主要表达在卵母细胞上(图1E)。
2.2 BMP15对体外培养的卵巢细胞的促增殖作用体外培养第4天雏鸡卵巢3 d,BrdU染色结果发现,BMP15 100 μg/L 处理组中BrdU阳性细胞的百分比最高(P<0.01)(图2A,B)。同时检测100 μg/L 的BMP15对卵巢中细胞增殖和凋亡的影响。免疫组化结果显示,3种增殖相关蛋白基本都位于卵巢的皮质,PCNA、CDK2和CCND1蛋白在颗粒细胞和卵母细胞上都有表达,添加BMP15使3种蛋白染色阳性的着色都变得更深(图2C)。细胞凋亡相关蛋白BAX基本都位于卵巢的皮质,但是添加BMP15使其着色相对变浅(图2F)。Western
A.第5~9天雏鸡卵巢BMP15 mRNA的表达;B.第5~9天雏鸡卵巢BMPR1B mRNA的表达;C,D.在第4~9天雏鸡卵巢中BMPR1B蛋白的表达及灰度分析;E.BMPR1B的免疫荧光。三角形指向卵母细胞,箭簇指向颗粒细胞;不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同
blot分析结果表明,体外培养时添加BMP15可以显著增加雏鸡卵巢中颗粒细胞和卵母细胞的PCNA、CDK2和CCND1蛋白含量(P<0.05)(图2D,E),并且显著减少BAX蛋白的表达,显著增加BCL2蛋白的表达(P<0.05)(图2G,H)。根据以上结果,在体外试验中,选择100 μg/L的BMP15用于后续试验。
A.B.BrdU荧光染色及阳性细胞比例,箭镞表示卵巢皮质中具有BrdU(白色)标记的颗粒细胞和卵母细胞;C~H.BMP15对细胞增殖和抗凋亡的影响;C.PCNA、CDK2和CCND1免疫组化,箭镞表示染色的颗粒细胞和卵母细胞;D,E.100 μg/L BMP15处理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析;F.箭镞为BAX染色的卵母细胞;G,H.BAX和BCL2蛋白的Western blot和灰色分析
2.3 BMP15对雏鸡卵巢细胞的促增殖作用在体试验表明,雏鸡注射1 μg/kg的BMP15后,PCNA免疫组化染色阳性的着色加深(图3A)。Western blot分析表明,与对照组相比,注射1,5 μg/kg的BMP15均可显著增加PCNA的表达量(P<0.05)(图3B,C)。结合免疫组化和Western blot的结果,1 μg/kg BMP15处理组显著提高了颗粒细胞和卵母细胞中PCNA的含量。此外,与对照组相比,1 μg/kg BMP15处理组PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表达量分别增加了62%,70%和63%(P<0.05)(图3D,E)。
A.PCNA免疫组化,箭簇表示染色的颗粒细胞和卵母细胞;B,C.添加BMP15对PCNA蛋白的Western blot和灰色分析;D,E.1 μg/kg BMP15处理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析
2.4 BMP15对体外培养雏鸡卵巢缝隙连接的影响通过透射电镜观察卵母细胞和颗粒细胞间的缝隙连接。本试验在BMP15处理后的卵泡超微结构中观察到了卵母细胞和颗粒细胞间的缝隙连接(图4A),而在对照组中没有观察到缝隙连接。此外,Western blot的结果显示,BMP15处理组与对照组相比卵巢组织中缝隙连接相关蛋白CX43的表达量增加了86.8%(P<0.05)(图4B,C)。
A.对照组以及BMP15处理组卵巢组织的超微结构,箭镞表示缝隙连接,O.卵母细胞,GC.颗粒细胞;B,C.添加BMP15后,缝隙连接相关蛋白CX43表达变化的Western blot结果和灰色分析
2.5 BMP15在体外促进原始卵泡的激活由于BMPR1B的表达在原始卵泡激活过程中显著增加,本试验研究了BMP15对原始卵泡激活的直接作用。ML347是BMP15受体BMPR1B的抑制剂。在体外试验中,BMP15和ML347单独或联合处理4日龄雏鸡卵巢组织3 d。PCNA免疫荧光和TUNEL的结果表明,BMP15处理组与对照组相比,卵巢皮质中PCNA阳性细胞数量增加,TUNEL阳性细胞数量下降。ML347和BMP15联合处理组与BMP15单独处理组相比,卵巢皮质中PCNA阳性细胞数量减少,TUNEL阳性细胞数量增加(图5A)。qRT-PCR的结果显示,BMP15处理组与对照组相比,PCNA和CDK2 mRNA的表达分别增加了2.4倍和2.7倍,凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)和BAX mRNA的表达分别降低了47.9%和74.2%(P<0.05)。而ML347和BMP15联合处理组与BMP15单独处理组相比,PCNA和CDK2 mRNA的表达量分别降低了97.5% 和94.3%,显著增加Caspase3和BAX的mRNA表达量(P<0.05)(图5B~E)。Western blot结果表明,ML347和BMP15联合处理组与BMP15单独处理组相比显著降低PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表达量,显著增加BAX蛋白的表达量(P<0.05)(图5F,G)。
A.BMP15和ML347单独或联合处理体外培养的第4天雏鸡卵巢3 d,箭簇表示PCNA(红色)和TUNEL(绿色)的颗粒细胞;B~E.PCNA、CDK2、Caspase3和BAX mRNA的表达;F和G.PCNA、CDK2、CCND1和BAX蛋白的Western blot和灰色分析
2.6 BMP15通过Smad1、Smad5和Smad4信号通路激活原始卵泡通过Smad1、Smad5和Smad4信号通路检测BMP15对原始卵泡的激活。结果显示,Smad1、Smad5和Smad4 mRNA在第7天的雏鸡卵巢中表达与第5和6天相比显著增加(P<0.05),此时间点与原始卵泡激活时间一致(图6A~C)。体外试验BMP15处理3 d后qRT-PCR结果显示,BMP15处理组与对照组相比,雏鸡卵巢中Smad1和Smad5基因表达量提高1.2倍和1.4倍,Smad4的基因表达量提高了3.2倍(P<0.05)(图6D~F);Western blot结果表明,BMP15处理组与对照组相比,显著增加Smad1、Smad5和Smad4的蛋白表达量(P<0.05)(图6G,H)。之后,将BMP15和ML347单独或联合培养4日龄雏鸡卵巢组织3 d,验证BMP15在体外通过受体BMPR1B激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4。Western blot结果表明,ML347和BMP15联合处理组与BMP15单独处理组相比降低了Smad1、Smad5和Smad4蛋白的表达量68.8%,62.9%和83.6%(P<0.05)(图6I,J)。
A.C.雏鸡卵巢中Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表达量随日龄的变化;D~H.采用Western blot和qRT-PCR检测体外BMP15处理后Smad1、Smad5和Smad4 mRNA和蛋白的变化;I,J.BMP15和ML347单独或联合处理后Smad1、Smad5和Smad4的Western blot和灰色分析
家禽卵巢中原始卵泡的激活是一个动态变化的过程,受多种细胞因子、信号通路和激素的精确调控。BMP15在某些物种中参与细胞增殖和分化,这一过程对原始卵泡的激活至关重要[19]。然而,BMP15促进雏鸡原始卵泡激活的机制尚不清楚。本试验初步确定了体内外试验中BMP15处理雏鸡卵巢组织的有效浓度。
BMP15通过两种不同的受体BMPR1B和BMPRII转导其信号通路。在家禽卵巢中BMPR1B和BMPRII基因表达量随着卵泡的增大而增加,表明BMP15可能在家禽卵泡发育过程中发挥重要作用[12,14]。雏鸡孵化后的第7天,原始卵泡被激活[4],结果显示,BMP15和BMPR1B的基因表达量以及BMPR1B的蛋白表达量在此时间点达到最高点;说明BMP15在雏鸡卵巢原始卵泡的激活过程中发挥重要作用。
BMP15促进卵巢中卵母细胞和颗粒细胞之间缝隙连接的形成[20]。本试验中BMP15处理雏鸡卵巢后缝隙连接相关蛋白CX43的表达量明显上调。卵母细胞的发育是通过卵巢中各结构之间相互作用进行的。缝隙连接在卵母细胞与颗粒细胞之间物质信息交换的过程中起着重要的作用[21]。CX43是缝隙连接中的一种连接蛋白,在卵泡发育过程中发挥了关键的作用[22]。本试验结果表明,BMP15通过增加CX43蛋白的表达,增强卵母细胞与颗粒细胞之间的物质信号交换,从而促进原始卵泡的激活。
此外,有研究表明,BMP15可促进卵巢中细胞的增殖,抑制细胞的凋亡[23]。原始卵泡的激活与卵巢细胞的增殖和凋亡密不可分。本试验结果表明,与对照组相比,添加BMP15处理增加了卵泡发育过程中与细胞增殖相关的PCNA蛋白、细胞周期蛋白CDK2和CCND1的表达。同时,添加BMP15处理增加了BCL2的蛋白表达,降低了BAX的蛋白表达。此外,与对照组相比,添加BMP15处理后TUNEL阳性标记结果高于对照组。说明添加BMP15处理促进了细胞的增殖,抑制了细胞凋亡的发生,体外和体内试验支持了这些观点。特异性的受体抑制剂ML347能够阻止BMP15的效应,所以在ML347和BMP15联合处理组中检测到细胞增殖蛋白PCNA、细胞周期调节蛋白CCND1和CDK2的表达水平降低,细胞凋亡蛋白BAX表达量增加。因此,BMP15能够通过调控雏鸡卵巢中细胞增殖蛋白和细胞程序性死亡蛋白来激活原始卵泡。
BMP15通过刺激下游信号通路Smad/1/5/8通路来激活人卵巢中的原始卵泡[17,24]。并且,Smad1和Smad5在小鼠原始生殖细胞的发育过程中起着重要作用[18]。本试验结果表明,雏鸡体内Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表达的变化在出雏后第7天显著升高,这与雏鸡原始卵泡激活的时间一致。通过检测阻断剂ML347阻断受体BMPR1B后BMP15是否对雏鸡原始卵泡仍具激活作用,确定BMP15是否通过激活Smad信号通路来激活原始卵泡。结果表明,BMP15通过激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4促进原始卵泡的激活,而ML347会显著减弱BMP15的这种刺激作用。说明在原始卵泡活化过程中,BMP15通过受体BMPR1B刺激下游信号通路Smad1、Smad5和Smad4,促进原始卵泡激活。
在雏鸡原始卵泡的激活过程中,BMP15通过BMPR1B受体激活Smad1、Smad5和Smad4信号通路从而促进卵巢中细胞的增殖,抑制细胞的凋亡。此外,BMP15通过增强卵母细胞和颗粒细胞之间的缝隙连接促进了原始卵泡的激活。这些作用对于雏鸡原始卵泡的生长发育起着至关重要的作用(图7)。
图7 BMP15激活原始卵泡过程的示意图