河南省牛肠道病毒的遗传变异分析

常晓冉,林 倩，钱明珠，胡俊英，李 欣，古丽巴哈尔·图尔荪,王新平，3*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.河南农业职业学院，河南 郑州 451450；3.吉林大学 人兽共患病研究所 教育部人兽共患病重点实验室，吉林 长春 130062)

肠道病毒(enterovirus,EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，是引起人类与动物临床上以消化系统、呼吸系统和神经系统症状为特征疾病的病原体[1-3]。肠道病毒目前分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种，其中E种肠道病毒(EV-E)和F种肠道病毒(EV-F)统称为牛肠道病毒(BEV)，主要感染牛只[4-6]。作为小RNA病毒科肠道病毒属中的成员之一，BEV为无囊膜的单股正链RNA病毒，具有典型的二十面体立体对称的球形结构。病毒粒子大小为 25～30 nm，基因组全长为7 300～7 500 bp。基因组中仅有1个开放阅读框(ORF)，可直接作为mRNA翻译出1个前体多聚蛋白，该蛋白经过一系列降解，形成4种结构蛋白( VP1、VP2、VP3 和VP4) 和7种非结构蛋白( 2A、2B、2C、 3A、3B、3C和3D)[7-8]。在肠道病毒的4种结构蛋白中，VP1、VP2和VP3位于病毒粒子表面，病毒主要抗原表位位于其上，可诱导机体产生抗体[9]。而7种非结构蛋白在病毒基因组复制、转录与翻译等过程中发挥重要作用。

BEV的分类经历了多次变动。目前，依据病毒基因组序列的差异，国际病毒分类委员会将BEV分为EV-E和EV-F 2个种，前者包括EV-E1～EV-E5共5种基因型，后者包括EV-F1～EV-F7共7种基因型。在肠道病毒中，VP1蛋白是病毒基因组编码的衣壳蛋白，暴露在病毒粒子最外部，该蛋白可构成2个重要结构“峡谷”和“口袋结构”。二十面体五重轴周围的凹陷称为“峡谷”[10]；而疏水性“口袋结构”主要暴露在峡谷的表面，可以稳定病毒粒子。肠道病毒通过VP1与特异性受体(如SCARB2)结合感染细胞，导致疏水“口袋结构”从“峡谷”底部排除，进而引起病毒不稳定,这种不稳定可能是基因组释放的前提[11]。VP1含有6个表面环(BC、DE、BE/aB、GF、GH和HI)，主要位于二十面体五重轴周围，暴露在病毒粒子表面，是病毒的主要可变区域[12]。VP1蛋白富集多个中和表位区，因而被认为是中和抗体的主要靶标，具有最多的型特异性中和位点。由于VP1蛋白编码基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，通过扩增全长VP1序列，构建系统进化树与对比VP1区核苷酸同源性进而判断所分离病毒的血清型[13]。

本实验室前期对河南省牛群BEV感染进行了流行病学调查，发现河南省不同地区的牛群存在BEV感染。为了进一步确定河南省不同地区感染的BEV毒株的遗传变异与分子差异，本研究应用RT-PCR方法扩增了不同BEV毒株的VP1基因，并进行了序列测定与比对分析，确定出BEV毒株的分子差异，为河南省BEV的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理待检粪便样品如参考文献[14]所示，采集于河南省5个地区(编号为RZ、ZM、JX、SQ、XX) 的5个奶牛场有腹泻症状的病牛群，其处理方法参照文献[15]进行。

1.2 主要试剂与仪器DMEM购自Gibco (美国) 公司;胎牛血清(FBS)购自海克隆生物公司;Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒、Premix Taq 酶，均购自 TaKaRa公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、pGM-T载体试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；PCR扩增仪，购自杭州博日科技有限公司;电泳仪，购自上海天能科技有限公司;显微镜，购自上海立光精密仪器有限公司。

1.3 引物的设计与合成根据基因文库收录的部分EV-E和EV-F肠道病毒的核苷酸序列，分别设计合成1对 EV-E和EV-F的特异性引物，用于扩增BEV的VP1基因序列。EV-E引物序列为EV-E-S:5′-CGAGACCGGTGCAACATCCA-3′,EV-E-AS:5′-CGGGGGCCCTTCGGTATC-3′;EV-F引物序列为EV-F-S:5′-TGGCGGAATTGGTAGGTGGATAGT-3′,EV-E-AS:5′-AGGTGTTTGGGCTTCGCATAGA-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 病毒分离及培养将病料以PBS按照1∶5(W/V)比例稀释后，8 000 r/min离心10 min,上清液用0.45 μm滤器过滤，然后将滤液接种于生长密度为70%的单层Vero细胞，37℃、5%CO2培养箱中感作2 h后弃掉接种物，以 Hank’s 液洗涤细胞2次后，加入含有2% FBS的DMEM细胞培养液培养，每4～6 h 观察细胞1次。细胞接种病料48 h 后，将其反复冻融3次，收集病毒液，置于-80℃保存。将收获的病毒液连续传至第5代，-80℃ 保存。

1.5 病毒分离株抗原交叉的检测采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)进行[14]。将分离病毒株接种单层Vero细胞，待细胞出现30%左右的病变后，以甲醇于-20℃固定15～20 min。以兔源抗HY12病毒 VP1多克隆抗体和兔源抗SD-S67 毒株VP1多克隆抗体为一抗[15-16]，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗，经显色后置于显微镜下观察并记录结果。同时设置阴性血清对照和未接毒细胞对照。

1.6 病毒RNA的提取及VP1基因序列的扩增应用天根生化科技有限公司的TRIzol 试剂盒提取BEV阳性样品或细胞分离毒株的RNA，然后以Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒进行病毒cDNA的合成。应用PCR方法，以上述合成的cDNA为模板，扩增VP1基因。扩增条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶进行鉴定。

1.7 PCR产物或阳性克隆的序列测序将PCR产物直接进行序列测定或将PCR扩增的目的DNA片段连接到T载体上，酶切鉴定得到的阳性质粒送至上海生工有限公司测序。

1.8 序列比对分析采用文献[17]方法进行。应用Lasergene DNAStar和MEGA 7.0软件将测序获得的样本序列与GenBank中BEV代表毒株的VP1序列进行同源性比较和进化树分析，确定获得序列之间的同源性及差异性。

2 结果

2.1 病毒的分离及其致细胞病变特征单层Vero细胞接种处理样品后，一般于12～24 h后开始出现细胞皱缩变圆、聚集、透光性增强，之后细胞逐渐脱落死亡等病变现象(图1A～C)。少数样品盲传2～5代才能观察到明显的细胞病理变化。病毒分离结果如图1所示。

A～C.代表毒株接种Vero细胞引起的细胞病变；D.正常细胞对照

2.2 分离毒株间免疫学交叉反应以IPMA检测分离毒株感染的细胞，确定分离毒株与EV-E和EV-F参考毒株间是否存在交叉反应。结果如图2所示，应用抗HY12-VP1和SD-S67-VP1的多克隆抗体，检测分离的EV-F及EV-E代表毒株。与未接毒的细胞相比(图2G，H)，在接毒细胞的胞浆中观察到大量的、信号非常强或比较强的染色(图2A，B,D,E)。同时，应用EV-E和EV-F抗血清检测正常细胞(图2G,H)以及兔阴性血清检测EV-E和EV-F接毒细胞及正常细胞(图2C,F,I)时，均未观察到信号。上述结果说明分离毒株与EV-E和EV-F参考毒株之间存在着免疫学交叉反应。

A.D,G.HY12毒株高免血清检测分离的EV-E、EV-F和正常细胞对照结果；B,E,H.SD-S67高免血清检测分离的EV-E、EV-F和正常细胞对照结果；C,F,I.兔阴性血清检测分离的EV-E、EV-F和正常细胞对照结果(40×)

2.3 PCR扩增分离毒株VP1基因的结果应用EV-E和EV-F特异性引物，进行VP1基因的PCR扩增。结果如图3所示，获到了预期大小的目的条带。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.EV-E样品；9～11.EV-F检测样品；N.阴性对照

2.4 河南省牛群存在EV-E和EV-F病毒感染将扩增出VP1基因片段进行序列测定与比对分析，结果如图4所示。河南省不同地区分离毒株HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84、HeN-C4之间的同源性为70.2%～98.6%，与国内首株E种肠道病毒HY12毒株VP1序列的同源性为69.3%～80.3%。其中分离株HeN-C4和HeN-A3与HY12的同源性比较低，只有69.3%和69.5%，而HeN-A2与HY12同源性最高，其同源性为80.3%；与国外BEV病毒株比较，结果HeN-B84与BEV-K2577的同源性最高，仅为78.1%(红色方框所示)。与此同时，上述8株病毒与EV-F同源性只有50.3%～58.4%(绿色方框所示)，依据肠道病毒种的分类标准，上述8株病毒应分类为EV-E毒株。

BEV分离株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91与EV-F代表株具有较高的同源性，其中HeN-A12与国内首株EV-F毒株BHM26的同源性为68.6%，而与SD-S67的同源性最高，为88.8%，其次与Alpaca-KC748420的同源性比较高，为82.2%；HeN-YR91分离株与BHM26毒株的同源性为70.8%，与SD-S67毒株的同源性为73.7%；而HeN-B62与其他EV-F肠道病毒的同源性相比于HeN-A12和HeN-YR91毒株来说比较低，同源性为54%～76.9%(黄色方框所示)。同时，与EV-E病毒株相比，3株分离株与其同源性为53.6%～58.7%(蓝色方框所示)，表明3株分离株分类为EV-F毒株。所述结果表明，河南省牛群中同时存在着EV-E和EV-F的混合感染。

图4 BEV河南分离株与国内外BEV代表毒株VP1核苷酸序列同源性比较

2.5 河南省BEV毒株的遗传多样性与基因型差异应用MEGA 7.0 软件将分离毒株的序列比对分析后，采用临近法(Neighbor-Joining)构建进化树，如图5所示。河南省不同地区分离株可以分为4个不同的分支，其中HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84、HeN-C4这8株分离株与EV-E毒株同属于一个大分支，表明上述8株分离株均属于EV-E。进一步分析发现河南省牛群中EV-E存在2种不同的基因型，分离株HeN-A2与HY12和国外分离得到的毒株D-14-3-96同属于一个分支，且同源性最高，为EV-E3；HeN-B81、HeN-B72、HeN-B83、HeN-B78、HeN-B84、HeN-A3和HeN-C4与国外分离到的K2577、SL305、PS42和PS83毒株同属于一个分支，表明这7株河南分离毒株为EV-E2分离株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91与EV-F同属于一个大分支。进一步分析显示，3株病毒株存在着2种不同的基因型。其中HeN-A12和HeN-YR91分离株与本实验室分离得到的F种羊源肠道病毒SD-S67同属于一个分支，为EV-F1；而HeN-B62与毒株EV-F4血清型的代表毒株BEV-Enterovirus-W1同源性最高，同属于一个分支，为EV-F4。

▲.BEV新分离株序列；○.2012年及2018年实验室分离的EV-E和EV-F毒株

3 讨论

BEV感染可引起一种临床上以严重消化道、呼吸道症状为特征的传染病，母牛感染后引起繁育障碍如不孕或流产等，某些牛只呈现隐性感染。本病最早于1959年由MOLL等[2]首次报道，之后国外许多国家也报道有本病的发生与流行。国内LI等[6]于2008年从内蒙古腹泻犊牛体内分离出我国第一株F种肠道病毒。之后邢泽黎等[15]于2012年从吉林省某发病牛群中分离出国内首株E种肠道病毒 HY12毒株，并对其分子特性以及遗传变异等情况进行研究。对吉林省不同地区分离的BEV毒株的遗传变异进行分析发现，BEV毒株的同源性存在明显差异[18]。BEV属于小RNA病毒科、肠道病毒属的成员，为单股正链RNA病毒。根据病毒基因组非结构蛋白和5’UTR序列的差异，可将其分为EV-E和EV-F 2个种。 而同一肠道病毒种依据VP1结构蛋白序列的差异又可进一步分为不同的基因型。截止目前，EV-E分为5个基因型(EV-E1～EV-E5)，EV-F分为7个基因型(EV-F1～EV-F7)。河南省为国内牛羊养殖大省，有关BEV感染及其病毒株的差异缺乏研究。本研究应用前期制备的抗HY12-VP1和SD-S67-VP1多克隆抗体，对从河南省分离的11株BEV进行IPMA试验，结果发现分离毒株分别与HY12毒株(EV-E)和SD-S67毒株(EV-F)抗体发生特异性反应。同时比较分析不同毒株的序列差异，发现河南省牛群中同时存在着E种和F种肠道病毒感染[19]。其中，HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84和HeN-C4这8株病毒株为E种肠道病毒；分离毒株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91为EV-F。对不同毒株VP1基因进行了扩增、序列测定与分析，分离的8株E种肠道病毒可进一步分类为EV-E2和EV-E3，而HeN-A12及HeN-YR91与羊源F种肠道病毒SD-S67同属于EV-F1， HeN-B62与EV-F4血清型代表毒株BEV-Enterovirus-W1属于EV-F4。本研究揭示出河南省分离BEV的遗传变异及毒株的分子差异，发现牛群中同时存在着EV-E和EV-F毒株的混合感染，确定了分离毒株的基因型，上述结果为今后河南省BEV的预防及深入研究奠定了基础。