16S rRNA基因测序分析犬骨癌的癌内菌群特征

李 晔,张玉珠,霍俊元,唐明瑞,蔡桦林,孙真真,刘祥雨,谢光洪*,刘 云*

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

随着社会的进步，以及我国生活水平的提高，伴侣动物犬的饲养数量也大幅度提升，近几年国内小动物医学方面也得到了迅速发展[1]。骨肿瘤属于临床上较为常见的犬骨病，约占组织肿瘤的57%，且恶性骨肿瘤的比例较大，临床上以跛行、病变处肿胀、骨折为主[2-3]。截肢术是常采用的治疗手段，但是在大多数病例中不太理想，少数病例在术后仅存活6～8个月。犬骨癌的发生可能与年龄、品种、外界感染有关，但是犬骨癌发病原因尚不清楚，因此临床上还无法有效预防[2,4]。微生物感染是癌症的发病因素之一，全世界超过16%的癌症发病率归因于微生物感染[5]，且最近有研究证明，不同类型癌症的肿瘤内均存在细菌，且其多样性和组成可以影响宿主的免疫反应和疾病的自然病程[6-7]。这些研究提示了调节肿瘤内细菌可能成为一种使肿瘤对治疗敏感的新策略。但犬作为人癌症研究的常用动物模型，犬骨癌的癌组织内是否含有细菌，这一问题到目前为止是未知的。

16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)因其高变区具有属或种的特异性，可以作为揭示生物物种的特征核酸序列， 被认为是细菌系统发育和分类的最适合指标。迄今，16S rRNA已被广泛用于肠道、口腔、胃黏膜、乳腺、肺、胰腺、骨癌病变部位等的菌群组成结构研究[8-12]。例如NEJMAN等[8]利用16S rRNA扩增子测序分析了1 010例癌症患者(包括乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胰腺癌、卵巢癌、骨癌以及多形性胶质母细胞瘤)的癌组织样本，结果表明不同的癌症类型中菌群丰度不尽相同。

因此，本研究基于16S rRNA基因测序技术，通过提取骨癌患犬的癌组织和癌旁组织的基因组总DNA，进行高通量测序并结合数据分析骨癌患犬的肿瘤内是否存在细菌以及菌群的结构组成、丰度和多样性，为犬骨癌的早期诊断和新治疗手段的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂组织DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物由吉林省库美生物科技有限公司合成；PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶购自长春市生物技术有限公司。

1.2 样品采集6份肿瘤组织(BC)和6份癌旁组织(PBC)均来源于福州省福州市千宠百爱动物医院的确诊骨癌犬：术后即刻在无菌超净台用手术锯切割放入1.5 mL无菌EP管，并快速置于-80℃低温冰箱中冷冻保存。

1.3 基因组DNA的提取和PCR扩增通过提取骨癌患犬的癌组织和癌旁组织总DNA来对其菌群进行分析。首先对两种组织分别进行研磨，然后利用组织DNA提取试剂盒对组织的基因组总DNA 进行提取，并检测DNA的纯度和浓度。取适量的组织DNA于高压灭菌过的1.5 mL EP管中，使用ddH2O将DNA稀释至1 mg/L。以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增。PCR反应程序：98℃预变性1 min；98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃终延伸10 min。最后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并利用胶回收进行纯化。

1.4 序列测定高通量序列测定采用的测序平台是NovaSeq PE250，测序区域为16S rRNA 的V3-V4区，序列长度在250 bp左右，测序工作由诺禾致源测序公司完成。

1.5 生物信息分析利用Uparse软件对所有样本的全部数据进行聚类，以97%相似性将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。Alpha多样性指数使用Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Coverage分析样本内骨癌患犬的癌内菌群和癌旁菌群的丰富度和多样性。Beta多样性分析体现2组之间的差异程度。应用LEfSe分析寻找组间差异有统计学意义的生物标志物，展现不同组中丰富显著的菌种。选取丰富度排名前35的功能及它们在每个样品中的丰富信息，并从功能差异层面进行聚类，并进行Tax4Fun功能预测分析。

1.6 统计分析应用Wilcox秩和检验对犬骨癌癌内菌群与癌旁菌群的α多样性指数进行差异比较，组间差异菌群分析采用t检验对组间的菌群丰富数据进行假设检验以筛选差异有统计学意义的菌群。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OTUs分析为了研究骨癌患犬的癌内菌群，对6例患犬的细菌16S rRNA基因扩增子进行高通量测序用于比较癌组织与癌旁组织之间的菌群特征。由表1可知，12个组织样品(6个癌组织与6个癌旁组织)共获得766 209条原始序列，原始序列经过过滤低质量和短长度后得到717 887条优化序列，最后经过过滤嵌合体后用于后续分析的有645 813条序列，平均长度为256 bp，其中癌组织(BC，n=6)共有300 222条有效序列；癌旁组织(PBC，n=6)共有345 591条有效序列。OUT聚类分析后，我们发现12例样品2组共有7 642个OUT，其中骨癌组织有1 648个特有OUT，癌旁组织有1 895个特有OUT，剩下的4 102个OUT是2组共有的，说明了大部分菌群为两者共有，小部分特殊菌群为癌组织特有(图1)。

表1 数据、数理统计及质控

图1 组间韦恩图

2.2 癌组织与癌旁组织Alpha多样性比较图2是以97%的一致性进行稀释曲线的绘制，曲线趋于平缓，说明本试验测序数据合理。由表2可知，对患犬癌组织(BC组)和癌旁组织(PBC组)的Alpha多样性分析表明， Shannon、Simpson、Chao1、Ace指数均无显著性差异(P>0.05)，Coverage指数(即样本菌群覆盖率)均高达98%。

图2 稀释曲线

表2 癌组织(BC)和癌旁组织(PBC)Alpha多样性分析

2.3 癌组织与癌旁组织Beta多样性比较使用主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)将多维数据降维，对样本之间的物种多样性关系进行描述。如果样本的物种丰度和构成越相似，则其在PCoA图中的距离越近。由图3可知，癌组织菌群明显聚集，且与癌旁组织菌群有一定的差异。

图3 癌组织与癌旁组织菌群的PCoA分析

对于癌组织和癌旁组织细菌丰富排名前10的菌群进行门水平分析，结果由图4可知，2组分别有10个菌门，其中癌组织的优势菌门有变形菌门(Proteobacteria，39.09%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，14.21%)、厚壁菌门(Firmicutes，13.25%)、广古菌门(Euryarchaeota，6.39%)和螺旋菌门(Spirochaetota，2.12%)；癌旁组织的优势菌门有变形菌门(Proteobacteria，52.35%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，9.99%)、厚壁菌门(Firmicutes，18.40%)和梭杆菌门(Fusobacteriota，1.85%)。由表4可知，癌组织的拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)以及螺旋菌门(Spirochaetota)显著高于癌旁组织(P<0.05)，其脱硫菌门(Desulfobacterota)极显著高于癌旁组织(P<0.01)。

A.不同样本；B.不同组别

对于癌组织和癌旁组织细菌丰富排名前10的菌群进行属水平分析，结果由图5可知，癌组织菌群优势菌相对丰度从高到低分别是：假单胞杆菌属(Pseudomonas，2.56%)、乳杆菌属(Lactobacillus，2.49%)、链球菌属(Streptococcus，1.83%)、埃希-志贺菌属(Escherichia-Shigella，0.61%)；癌旁组织优势菌相对丰度从高到底分别是：假单胞杆菌属(Pseudomonas，9.27%)、链球菌属(Streptococcus，3.82%)、乳杆菌属(Lactobacillus，2.27%)、梭杆菌属(Fusobacterium，1.49%)。由表5可知，癌组织的甲烷杆菌属、互营杆菌属以及Sarcina属显著高于癌旁组织(P<0.05)，有趣的是癌旁组织中不含有Sarcina属。

A.不同样品；B.不同组别

表4 癌组织与癌旁组织菌群门水平丰度

表5 癌组织与癌旁组织菌群属水平丰度

2.4 LDA差异贡献分析LEfSe (LDA Effect Size)用于分析发现和解释高维度生物标识(基因、通路和分类单元)，比较2组的差异物种进而寻找差异显著的Biomarker[13]。利用LEfSe分析发现差异物种并通过LDA(线性判别分析)评估差异物种的影响影响程度，即得到LDA score。通过对BC-PBC的LEfSe分析，我们发现LDA score>4的biomarker共有27个，包括硝化螺旋菌属(Nitrosococcaceae)、反刍甲烷杆菌(Methanobacterium)、拟杆菌门(Bacteroidota)、Exilispira、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单胞菌目(Pseudomonadales)等(图6A)。其中，代表癌组织的红色节点在以下4个进化树上是富集的(图6B)，起到主要差异作用：(1)拟杆菌门(Bacteroidota)—拟杆菌纲(Bacteroidia)—拟杆菌目(Bacteroidales)—拟杆菌科(Williamwhitmaniaceae)；(2)广古菌门(Euryarchaeota)—甲烷杆菌纲(Methanobacteria)—甲烷杆菌目(Methanobacteriales) —甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)；(3)螺旋菌门(Spirochaetota)—螺旋菌目(Brachyspirales)—螺旋菌科(Brachyspirae)—未分类的短螺旋体属(Brachyspira)。代表癌旁组织的绿色节点在下一个进化树上是富集的(图6B)：γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)—伯克氏菌目(Burkholderiales)/假单胞菌目(Pseudomonadales)—假单胞细菌科(Pseudomonadaceae)。无差异物种标为黄色节点。

图6 LDA值分布柱状图(A)和进化分布图(B)

2.5 功能预测根据数据库注释结果，选取每个分组最大丰度排名前10的功能信息，对患犬的癌组织和癌旁组织菌群进行Tax4Fun功能分析，结果见图7。由图7A可知，2组菌群的功能相似，主要是代谢(metabolism)、基因信息处理(genetic information processing)和环境信息处理(environmental information processing)等，其中代谢通路和环境信息处理在功能丰度上具有极显著性差异(P<0.01)。由图7B可知，代谢功能主要包括碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、能量代谢(energy metabolism)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、辅助因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)、聚糖生物合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism)。基因信息处理功能中丰度较高的有膜转运(membrane transport)和信号转导(signal transduction)；环境信息处理功能中丰度较高的有翻译(translation)和复制与修复(replication and repair)。根据组间t-test检验，癌组织明显升高的通路有翻译(translation)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、能量代谢(energy metabolism)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、辅助因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)等通路(P<0.05)；癌旁组织明显升高的通路有膜转运(membrane transport)、复制与修复(replication and repair)、聚糖生物合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism)和脂质代谢(lipid metabolism)等通路(P<0.05)(图7C)。

图7 Tax4Fun功能注释相对丰度柱形图(A)和t-test组间差异分析(B和C)

3 讨论

有研究证实了癌症患者的癌组织中存在菌群，并进行了大致描述，发现每个癌症患者的癌组织都有其独特的菌群结构，并与健康人群存在显著性差异[8]。犬是常用于人癌症研究的动物模型[14]，其骨癌组织中是否含有菌群，这一问题在国际上尚未明晰。因此本研究通过高通量测序手段分析患骨癌犬的癌组织与癌旁组织菌群的特异性以及多样性，这对研究微生物与犬疾病的关系有着重要的理论和现实意义。

16S rRNA高通量基因测序方法常用于难以培养的微生物的直接鉴定分析，该方法已成为研究环境样本中微生物群落组成结构的关键技术[15-16]。本研究利用该方法对患犬的癌组织和癌旁组织的菌群进行全面的检测。尽管OUT准确度为3%就可以确定细菌的种分类水平， 但也存在物种数量被低估的可能性[17-18]，因此对16S rRNA基因V3-V4区的菌群组成进行了鉴定，并基于3%OUT间隙而非种水平分析菌群是从门到属分类水平的组成。另外，骨癌癌组织菌群可能受到环境或者其他因素的影响，故剔除一些含量较低的OUT，选取相对丰度较高的门和属进行组间比较分析。本试验结果表明，患犬的癌组织中存在菌群，其种类与癌旁组织相比无明显变化，2组样本在门水平的菌群主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)；在属水平上主要是绿脓杆菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)，这些结果表明癌组织处的微环境对细菌的生长和分布影响较小。我们发现癌组织与癌旁组织的Alpha多样性并无明显差别(P>0.05)，其菌群的高度相似表明了癌性病变处的微环境对菌群特征影响较小。而Beta多样性则有明显差异，在门水平上，癌组织的拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、脱硫菌门(Desulfobacterota)以及螺旋菌门(Spirochaetota)相对丰度显著高于癌旁组织(P<0.05)；在属水平上，癌组织的甲烷杆菌属、互营杆菌属以及八叠球菌属相对丰度显著增加。这些研究结果表明，这些菌门与菌属可能与犬骨癌的发生有关。为了进一步筛选出2组存在显著性差异的特异性细菌，我们进行了LDA差异贡献分析，结果发现2组共有27个物种存在显著性差异，其中影响力最大的5个物种有硝化螺旋菌属(Nitrosococcaceae)、反刍甲烷杆菌(Methanobacterium)、拟杆菌门(Bacteroidota)、Exilispira和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)。

目前的数据虽然表明这些细菌与犬骨癌之间存在潜在联系，但也不能够排除上述菌属在癌症发生、发展中仅仅作为旁观者存在的可能。它们在犬骨癌发生中的作用仍需进一步研究。在胃肠道癌症中发现，菌群组成发生改变，癌症中增加的物种可以用作癌症发现、风险评估和预后的生物标记物。本研究表明，在犬骨癌中，癌性病变部位的菌群特征存在改变，同时也发现了具有促癌特性的细菌，它们在犬骨癌中的作用有待进一步研究。