非编码RNA在子宫腺肌病发生发展中作用机制的研究进展

王思睿,段华

子宫腺肌病(adenomyosis，ADS)是一种以子宫内膜腺体和间质向子宫肌层不规则浸润为病理特征的妇科良性疾病[1]。ADS好发于育龄期妇女，发病率约为7%～23%，其主要临床表现为渐进性痛经、月经失调、子宫增大和生育力低下[2-3]，严重影响女性健康和生活质量。目前ADS的发病机制尚未完全阐明，多年来最被广为接受的是子宫内膜基底层内陷学说[4]，此外还有干细胞化生学说、炎症刺激学说、免疫学说等[3,5]。近年来随着分子生物学技术的更迭进步，ADS发病机制的相关研究在基因遗传和表观遗传方面取得了重大突破。而非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)作为表观遗传研究的重要组成部分，可通过调控相关基因的表达，在ADS子宫内膜及肌层细胞的增殖、凋亡、迁移及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等过程中发挥重要作用，进而影响ADS的发生发展。本文就ncRNA在ADS的病因机制中的作用进行综述。

1 ncRNA概述及分类

长期以来，编码蛋白的RNA一直是研究生长、发育及疾病调控的重点，但随着基因测序技术的发展，研究发现人类基因组中只有不到10%的基因负责编码蛋白质的合成[6]，而那些由DNA转录生成，却不翻译成蛋白质的一部分功能性RNA，即ncRNA，广泛存在于细胞中，并且在机体内通过发挥基因表达调控、细胞周期调节、染色质重塑和表观遗传修饰等重要作用，参与诸多生理、病理过程。

ncRNA分为管家ncRNA[如转运RNA(transfer RNA，tRNA)和核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)]以及调节ncRNA。调节ncRNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)等[7]。miRNA是一种长约22个核苷酸的内源性ncRNA，广泛存在于真核生物体内。miRNA可直接靶向结合基因的启动子调节基因表达，或通过与靶信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的非蛋白翻译区(3’UTR)结合，诱导靶mRNA的降解或翻译抑制，从而实现对基因的转录或转录后水平调控[8]。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的ncRNA，根据在细胞内的不同定位，lncRNA可发挥不同的作用[9]。胞质内的lncRNA主要通过调节靶mRNA的降解或翻译、或竞争性结合miRNA发挥内源性竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作用，在转录后水平调控基因表达；而胞核内的lncRNA主要通过控制特定基因的表观遗传状态、直接参加转录调控、参与可变剪接、或构成核结构域等分子作用机制发挥调控作用[10]。circRNA与传统的线性RNA不同，是一类不具有5’帽子和3’多聚A尾的共价闭合环状结构。研究发现circRNA是一类高丰度、种类多、时空特异性表达、序列高度保守的分子，尤其共价闭环结构可保护其免受核酸外切酶剪切，稳定性较线性RNA更高[11]。随着研究不断深入，circRNA参与遗传或表观遗传调控的分子生物学功能也逐渐明晰，包括竞争性结合miRNA、调控转录及可变剪接、与RNA结合蛋白相互作用等[12]。虽然ncRNA缺乏编码蛋白的能力，但其不仅可在各种细胞生命活动中发挥重要的生理性调节作用，其异常表达及调控亦是众多疾病致病过程的重要环节。

在妇科领域，ncRNA的异常表达被报道与卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌等妇科恶性肿瘤的发生及进展密切相关，也可能参与诱导包括子宫内膜异位症、ADS等良性疾病的致病过程。目前，关于ncRNA在恶性肿瘤的发生发展中作用机制的研究更为深入，但在ADS中的研究尚处于起步阶段，主要集中于对ADS子宫内膜和内膜肌层交界区细胞的功能调控，以及ADS患者相关临床表现的机制研究。

2 ncRNA对ADS细胞的功能调控

2.1 ncRNA参与调控ADS细胞侵袭、迁移及EMT过程

目前，ADS最被广为接受的发病机制假说为子宫内膜基底层内陷学说，认为子宫内膜上皮细胞的异常侵袭、迁移是ADS子宫内膜浸润肌层和异位增殖的基础[4]。牛磺酸上调基因1(taurine-upregulated gene 1,TUG1)是位于22q12.2染色体上的非蛋白编码基因，在小鼠视网膜细胞中被牛磺酸上调。研究表明，TUG1在各种人类癌症中表达上调，并具有促进细胞侵袭和迁移的能力[13]。经检测TUG1在ADS子宫异位内膜组织及上皮细胞中表达上调，并可通过招募EZH2到金属蛋白酶组织抑制剂2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2,TIMP2)的启动子区域对其组蛋白甲基化进行调控，增强子宫异位内膜上皮细胞的侵袭和迁移功能[14]。另外，近期一项研究对circRNA在ADS中发挥调控作用的具体机制进行了探索，研究发现，在ADS在位及异位内膜中均表达上调的circPVT1能够通过“分子海绵”作用调控miR-145/talin1轴，增强子宫内膜上皮细胞的侵袭、迁移能力[15]。

EMT是指上皮细胞转化为间质细胞表型的特殊细胞生物学过程，目前认为其在ADS的发生发展中起到重要作用。其特征是细胞间黏附丧失和运动性增加，与细胞的侵袭、迁移能力密切相关[16]。研究表明，miR-10b在ADS子宫在位及异位内膜中显著下调，而细胞实验证实miR-10b可上调钙黏蛋白E(E-cadherin)的表达，并通过PI3K-AKT通路抑制EMT过程，显著抑制细胞的侵袭与迁移，是ADS发病过程中的保护性因子[17]；同样，在ADS子宫内膜组织及上皮细胞中下调的miR-145-5p，可通过靶向结合踝蛋白talin1，激活典型的Wnt/β-catenin通路，诱导ADS子宫在位及异位内膜上皮细胞发生EMT，并增强其侵袭、迁移能力，以此参与ADS的发生发展[18]。

2.2 ncRNA参与调控ADS细胞增殖、凋亡功能

MIR22HG是一类经典的lncRNA，在诸多恶性肿瘤中表达下调，可经由Wnt/β-catenin、Notch、STAT3等多种信号通路调节，发挥其抑癌作用[19]。ADS作为一种表现出一定恶性生物学行为的疾病，已有研究表明MIR22HG在ADS中表达显著下调，体外实验证实MIR22HG可通过对miR-2861去甲基化的调控，介导其与信号传导与转录激活因子STAT3和基质金属蛋白酶MMP2的靶向结合，抑制子宫内膜细胞的增殖功能[20]。另有研究表明位于18q21.31号染色体上全长2.6 kb的Linc-ROR亦可在ADS中发挥调控作用，经检测，Linc-ROR在ADS子宫异位内膜中表达上调，并可以通过激活PI3K-AKT通路促进子宫内膜上皮细胞增殖，介导ADS的发生发展[21]。

另外，miRNA可调控子宫内膜肌层交界区(endometrial-myometrial interface，EMI)，也称子宫结合带(junction zone，JZ)的平滑肌细胞增殖功能。有研究表示，let-7作为一种在分化细胞中高表达，在过度增殖细胞中低表达的miRNA，因其对细胞增殖与分化的调节作用，在癌症中常与预后不良相关[22]。证据显示，let-7a在ADS子宫EMI平滑肌细胞中显著下调，其表达降低可抑制Hippo通路激活，从而增强EMI平滑肌细胞的增殖并抑制其凋亡[23]。而在ADS中，EMI作为子宫内膜与肌层间的“屏障”，其功能受损促进了子宫内膜向肌层的侵袭及异位种植，而EMI中平滑肌细胞的异常增殖活动可导致ADS子宫收缩异常，进一步破坏EMI屏障，在ADS的发生发展中起到重要作用[24]。

2.3 ncRNA参与调控ADS细胞血管生成

血管生成是ADS发生过程中的一个重要组成部分，因为异位子宫内膜的定植需要血液供应来维持其生存和生长。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最关键的血管生成因子之一，能够特异性作用于血管内皮细胞，以促进新生血管的形成[25]。研究发现在ADS患者子宫内膜中，血管内皮生长因子家族成员VEGFA表达显著上调[26]，而miR-205-5p可通过直接靶向结合VEGFA调控血管生成过程[27]。另外，有研究表明talin1可通过调控血管内皮生长因子家族成员VEGFB增强ADS子宫内膜间质细胞体外血管生成能力[28]，而miR-145-5p可调控talin1在ADS中的表达[18]。因此，ncRNA可能参与调控ADS异位内膜血管生成过程。

2.4 ncRNA参与调控ADS细胞炎症因子表达

近年研究发现ADS患者体内的炎症相关细胞因子的异常表达可能与ADS的发生发展密切相关，在ADS子宫内膜中，白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α，以及Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)均可介导ADS发生发展中的炎症途径[29-30]。Liang N等[31]的研究表明，lncRNA H19/miR-17/TLR4作用轴可通过上调TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17和IL-1β的表达介导ADS子宫内膜间质细胞的炎症反应，影响ADS的发生发展。

3 ncRNA与ADS患者临床表现的相关性

3.1 ncRNA与ADS患者痛经的相关性

渐进性痛经是ADS患者的典型临床表现，已成为许多患者选择子宫切除术的重要原因，目前关于ADS痛经的机制主要包括：局部前列腺素水平升高，缩宫素受体表达异常，炎性因子异常分泌，子宫EMI区结构功能异常等[29]。研究表明，在ADS肌层中过表达的缩宫素受体可导致子宫肌层收缩亢进加重ADS患者的痛经[32]，而miR-24可参与调节缩宫素的表达水平[33]，这说明miRNA可能与ADS患者的痛经存在关联。此外，近期一项研究发现，ADS患者的子宫EMI平滑肌细胞中存在miRNAlet-7a的低表达，且let-7a的表达水平与患者的痛经视觉模拟评分(VAS)呈负相关(P<0.001)[34]。这一结果进一步说明了miRNA与ADS患者的痛经程度有相关性，可能参与了ADS的痛经调控过程。

3.2 ncRNA与ADS患者不孕的相关性

ADS中有20%以上的患者合并不孕[3]，并且ADS与辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)术后的不良妊娠结局相关[35]，而子宫内膜功能失调(如子宫内膜容受性降低或蜕膜化受损)被认为是阻碍ADS患者成功妊娠的主要因素。蜕膜化是指子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)在月经黄体中期转化为特殊的蜕膜间质细胞(decidual stromal cells,DSCs)，以泌乳素(prolactin，PRL)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1,IGFBP-1)等为特征性标志物，为胚胎植入和胎盘发育提供营养和免疫豁免基质，并对妇女的子宫内膜容受性发挥控制作用[36-37]。近期有研究表明,miR-21在体外的ESCs中过表达后，可通过靶向下调KLF12，并上调NR4A1的表达，显著增强PRL及IGFBP-1的分泌，促使正常ESCs形态改变，诱导肌动蛋白丝(F-actin)紊乱，增强子宫内膜蜕膜化。研究进一步检测到在ADS子宫内膜组织及ESCs中，miR-21表达降低，蜕膜泌乳素(dPRL)分泌较正常子宫DSCs减少，而使用miR-21转染人ADS子宫的DSCs后，KLF12显著下调，PRL、IGFBP-1分泌增加，dPRL恢复正常分泌水平，表明miR-21的过表达可在体外逆转ADS造成的子宫内膜蜕膜化受损[38]。

此外，有研究表示lncRNA ENST00000433673在ADS患者子宫内膜组织及上皮细胞中表达下调，通过对下游靶mRNA的预测和功能注释，发现此lncRNA可以介导整合素ITGAL的上调，进而促进细胞间黏附分子ICAM1的表达和胚胎的黏附，从而影响ADS患者的胚胎植入过程[9]。

4 ncRNA在ADS诊断与治疗中的应用前景

ncRNA具备稳定且组织特异性表达的特点，这种表达使得ncRNA在作为疾病的诊断标志物方面具有良好的前景。由于ADS缺乏分子或基因标志物的诊断方法，故积极寻找有效的诊断标志物对于ADS的早期诊断具有重要意义。近期一项研究讨论了miRNA在ADS中可能发挥的诊断效能，研究选取33例ADS患者及30例健康女性的子宫内膜标本，对miRNA表达谱进行分析，应用双尾RT-PCR法检测发现9种差异表达的miRNA，对这63例样本进行受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析发现，单独的miRNA诊断效能较低。研究进一步发现将一个表达上调的miRNA和一个表达下调的miRNA组成“互惠对”可显著提高其对ADS的诊断效能，ROC分析曲线下面积(AUC)为0.74-0.77，敏感性65%～74%，特异性72%～86%，其中miR-181b/miR-10b的“互惠对”表达准确性最高，提示ncRNA有望为ADS的早期微创诊断提供一种新的方向[39]。另外，一项专利成果显示，血清中的循环miRNA可作为辅助诊断试剂盒用于ADS的分子筛查和早期无创诊断[40]。该研究通过高通量测序对ADS和正常对照组患者血清中的循环miRNA表达谱进行检测，发现miR-22-3p、miR-182-5p和miR-103a-3p在ADS患者血清中显著升高，研究进一步绘制了这3种miRNA的ROC曲线，分析显示miR-22-3p、miR-182-5p和miR-103a-3p的AUC分别为0.900(95%CI：0.839-0.961)，0.844(95%CI：0.766-0.921)和0.828(95%CI：0.747-0.909)，表明这些miRNA具有诊断ADS的潜力，可作为ADS的分子诊断标志物[41]。

在治疗方面，随着转化医学研究的不断深入，ncRNA对疾病的治疗潜力逐渐显露。研究发现，利用纳米技术将miRNA模拟物(miR mimics)导入癌灶中，可发挥其抑癌作用和调节肿瘤耐药性的功能，达到抑制肿瘤生长的目的，目前利用ncRNA对各类癌症进行靶向治疗的研究已进入临床试验阶段[42]。而在ADS中，虽然众多研究已表明ncRNA在调控ADS子宫内膜及EMI细胞功能方面发挥了重大作用，并一定程度影响ADS的临床表现，有望成为一种有效的ADS治疗手段，但目前研究主要集中于基础体外实验，未来仍需要进一步的动物实验和临床试验来证实。

5 总结与展望

随着分子生物学的不断发展，我们对疾病机制的认识逐渐深入到基因和表观遗传层面。而ncRNA作为表观遗传学领域中的关键研究方向之一，在包括肿瘤、心血管疾病、神经系统病变等疾病中均发挥了重要的调控作用。ADS作为一种常见但是临床治疗颇为棘手的妇科疾病，寻找其发病机制，并进一步为其诊治提供新的靶点，是妇科疾病研究中的重要一环。现今已有越来越多ncRNA与ADS的关联逐渐被发现。相信随着新一代测序技术的广泛应用、生物信息学的不断发展以及研究手段的多样化，ncRNA在ADS发生发展过程中的功能和作用机制将进一步被揭示，未来有望发现调控ADS发生发展过程的关键分子，为ADS的病因机制研究和分子靶向治疗提供新的切入点。