安罗替尼联合吉非替尼对吉非替尼耐药非小细胞肺癌PC9/GR细胞增殖的影响及其可能的作用机制

吴敏 金蒙蒙 曹晓慧 李永怀

作者单位：230061 合肥 安徽医科大学第一附属医院，安徽省公共卫生临床中心呼吸与危重症医学科

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发生与多种致癌基因突变密切相关，其中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶激活突变是最常见的NSCLC驱动基因变异，在亚裔非吸烟肺腺癌患者中，其突变频率高达40%～60%［1］。吉非替尼、厄洛替尼等小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是最早批准用于EGFR突变晚期NSCLC的靶向药。目前，大多数携带EGFR基因变异的NSCLC患者均在EGFR-TKIs靶向治疗中获得非常好的生存获益，但这种获益并非永久或无限期，后期仍不可避免地出现耐药性问题。因此，探寻新的治疗方案以克服EGFR-TKIs继发性耐药成为当前的迫切需要。

抗血管生成药物在晚期NSCLC的治疗中也扮演着非常重要的角色。近年来的研究还发现，抗血管生成药物与其他治疗药物联合能为患者带来更好的疗效及生存获益［2］。如，LI等［3］研究显示抗血管生成药物阿帕替尼联合吉非替尼可增强吉非替尼的抗肿瘤活性，延缓EGFR-TKIs继发性耐药的发生。安罗替尼作为一种新型的小分子口服多靶点抗血管生成药物，能抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，目前已批准用于晚期NSCLC的三线治疗［4］。安罗替尼联合EGFR-TKIs一线治疗EGFR突变NSCLC的临床研究也已初显疗效［5］，但其在EGFR-TKIs继发性耐药中的效应及其机制目前尚未明确。本研究通过体外研究初步探讨安罗替尼与吉非替尼联合给药在NSCLC吉非替尼继发性耐药细胞株中的抗肿瘤效应及其潜在的分子机制，以期为临床上克服NSCLC患者EGFR-TKIs继发性耐药提供可选的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人非小细胞肺癌PC9/GR（gefitinib resistance）细胞株购自中国科学院上海细胞库，根据本课题组前期研究提示原代PC9细胞株吉非替尼的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为（0.023±0.003）μmol/L［6］。吉非替尼（批号：2101251381，规格：250 mg/片）购自英国阿斯利康公司；安罗替尼（批号：210507183，规格：10 mg/片）由正大天晴药业集团股份有限公司惠赠；胎牛血清（FBS）和DMEM（高糖）购自美国Hyclone公司，二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）和噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2及β-Actin抗体购自美国CST公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析试剂盒及ECL化学发光试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及给药

PC9/GR细胞接种至DMEM培养液中（内含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素），并置于含5%CO2、37℃的恒温培养箱中常规培养。待细胞生长融合度达90%时，用0.25%胰酶消化传代。

将对数生长期的PC9/GR细胞制成单细胞悬液，按3 500/孔细胞密度接种至96孔板，同时设置6个复孔。依据不同给药情况将细胞分为四组：阴性对照组（仅含细胞和培养液）、吉非替尼单药组、安罗替尼单药组、吉非替尼和安罗替尼联合用药组。各组细胞置于细胞培养箱中孵育24 h，待细胞稳定贴壁后，单药组分别采用按不同浓度范围进行倍比稀释后的安罗替尼（0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L）或吉非替尼（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、16.0 μmol/L）给药，联合用药组分别以安罗替尼和吉非替尼各单药浓度按1∶4比例给药，各组细胞继续孵育72 h后，收集待用。后续细胞周期检测及Western blot实验所用药物浓度约为各单药的IC50。

1.3 体外MTT法检测细胞增殖情况

不同处理组的PC9/GR细胞在培养箱中孵育72 h后，吸出原培养基，每孔加入100 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，于37℃条件下继续孵育4 h，向每孔加入150 μL DMSO，用酶标仪轻轻震荡10 min。用自动酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度（OD）值，并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=［1-（加药组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）］×100%。采用SPSS 23.0软件计算各单药组的IC50，CompuSyn 2.0软件计算联合指数（combination index，CI），以CI＜1代表协同效应，CI=1代表相加效应，CI＞1代表拮抗效应。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期

PC9/GR细胞以1×105/mL密度均匀接种至6孔板中，培养24 h后，按上述1.2方法中的细胞分组和处理方式，加入终浓度为5.0 μmol/L的吉非替尼和（或）2.0 μmol/L的安罗替尼。各组细胞继续孵育72 h后，吸出原培养基，用PBS冲洗，胰酶消化后，离心，弃上清液，加入75%冰乙醇于4℃固定过夜。次日离心弃上清液，用冷PBS冲洗，加入PI染液，避光反应30 min后，上流式细胞仪检测。采用ModFit软件分析细胞周期分布。

1.5 Western blot检测 p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达

各组PC9/GR细胞经胰酶消化后，以1×108/mL密度接种于培养皿内，培养24 h后，按上述1.2方法中的细胞分组及处理方式，加入终浓度为5.0 μmol/L的吉非替尼和（或）2.0 μmol/L的安罗替尼。继续培养72 h后，提取各组细胞蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品，加入10%聚丙烯酰胺凝胶，经电泳、转膜、封闭后，加入p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2一抗（稀释比例均为1∶2 000），4℃ 孵育过夜；次日加入相应二抗孵育1 h，转入暗室后加入ECL发光液，最终得到目的蛋白条带。以β-Actin为内参，应用Image J 1.8软件进行蛋白条带的灰度值分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行处理，各实验至少重复3次，数据以均数±标准差（）表示，独立样本t检验用于两组间的均数比较，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 吉非替尼和安罗替尼单药对PC9/GR细胞增殖的影响

PC9/GR细胞用不同浓度的吉非替尼（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、16.0 μmol/L）和安罗替尼（0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L）分别处理72 h后，MTT法检测结果显示，不同浓度的吉非替尼和安罗替尼均对PC9/GR细胞增殖具有抑制作用，且在一定浓度范围内随着药物浓度增加而逐渐增强，具有浓度依赖性，见图1A～B。PC9/GR细胞经吉非替尼和安罗替尼作用72 h的IC50值分别为（4.83±0.15）μmol/L和（1.91±0.18）μmol/L，因此后续细胞周期检测及Western blot实验采用2.0 μmol/L安罗替尼和5.0 μmol/L吉非替尼处理。

2.2 安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞的增殖抑制效应

安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞的增殖抑制作用明显优于相应浓度单药组（均P＜0.05），见图1C。经CompuSyn软件计算，不同浓度安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞的CI值均小于1，平均CI值为0.448，见图2。以上实验结果表明，安罗替尼与吉非替尼联合对PC9/GR细胞具有协同抗增殖作用。

图1 MTT法检测不同浓度安罗替尼和吉非替尼对PC9/GR细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of anlotinib and gefitinib on the proliferation of PC9/GR cells detected by MTT assay

图2 吉非替尼与安罗替尼联合作用于PC9/GR细胞72 h的CIFig.2 CI of gefitinib combined with anlotinib for 72 h in PC9/GR cells

2.3 安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞周期的影响

安罗替尼（2.0 μmol/L）和吉非替尼（5.0 μmol/L）单药或联合处理PC9/GR细胞后，流式细胞仪检测结果显示，与阴性对照组比较，其余各组的G0/G1期细胞比例均增高（均P＜0.05），同时安罗替尼单药组的G2/M期细胞比例明显增高（P＜0.05）；与各单药组比较，联合用药组的G0/G1期细胞比例明显增多（均P＜0.001），相应的S期细胞比例则明显降低（均P＜0.001）。见图3。

图3 安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞周期的影响Fig.3 Effects of anlotinib and gefitinib combination on the cell cycle of PC9/GR cells

2.4 安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与阴性对照组比较，吉非替尼单药组p-AKT和p-ERK1/2表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），安罗替尼单药组p-AKT和p-ERK1/2表达水平明显下调（均P＜0.05）；联合用药组的p-AKT和p-ERK1/2表达水平则较阴性对照组及各单药组明显下调（均P＜0.01）。见图4。

图4 安罗替尼与吉非替尼联合用药对PC9/GR细胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达的影响Fig.4 Effects of anlotinib and gefitinib combination on p-AKT and p-ERK1/2 protein expression in PC9/GR cells

3 讨论

肿瘤分子靶向治疗具有特异性强、副作用小等特点，目前已成为携带敏感突变NSCLC患者主要的治疗方案［7］。然而，尽管EGFR驱动基因突变的晚期NSCLC患者使用EGFR-TKIs较传统化疗具有更好的临床疗效，但所有初始治疗有效的患者大多出现继发性耐药［8］。肿瘤新生血管的形成与肿瘤发生、发展及远处转移密切相关。EGFR-TKIs虽然具有一定的抗血管生成作用，但是肿瘤新生血管的形成也参与了EGFR-TKIs耐药［9］。抗血管生成药物主要通过阻断肿瘤滋养血管的形成，进而抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，目前在肿瘤联合治疗中起重要作用［2］。安罗替尼作为国产口服剂型的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可高效抑制血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）等多个参与血管生成的靶点，具有全面阻断肿瘤新生血管形成和抗肿瘤增殖作用［10］。目前，安罗替尼联合EGFR-TKIs一线治疗EGFR突变晚期NSCLC的Ⅲ期临床试验（ALTER-L004）已初显疗效，在ALTER0303试验［11］中安罗替尼联合EGFR-TKIs可延长EGFR突变NSCLC患者的无进展生存期及总生存期，同时延缓获得性耐药的产生。但对于EGFR-TKIs单药一线治疗后出现EGFR-TKIs获得性耐药的患者，以安罗替尼联合EGFR-TKIs作为二线治疗方案目前仅见个案报道［12］，因此其疗效尚不明确。本研究的体外实验研究发现安罗替尼联合EGFR-TKIs吉非替尼对吉非替尼获得性耐药NSCLC细胞PC9/GR的抗肿瘤增殖作用明显强于吉非替尼单药组和安罗替尼单药组，且两药联合的CI值小于1，提示两药具有明显的协同抗增殖效应。

目前有研究发现低浓度的安罗替尼可诱导HCC827 GR细胞株（吉非替尼继发性耐药NSCLC细胞株）发生G2/M期和G0/G1期细胞周期阻滞，且随着安罗替尼作用浓度的增高，处于G2/M期的细胞比例逐渐增多，从而导致细胞凋亡增加［13］。本研究也得出类似结果，安罗替尼作用PC9/GR细胞后可将其阻滞在G2/M期和G0/G1期，吉非替尼则主要将PC9/GR细胞阻滞在G0/G1期，两者联合后G0/G1期的细胞比例显著上升，而S期的细胞比例明显下降。表明这两种药物产生协同增殖抑制效应的机制可能与细胞周期阻滞在G0/G1期，从而阻碍了细胞进入DNA复制阶段的S期，进而抑制细胞增殖有关。

PI3K/AKT及MEK/ERK信号通路是EGFR基因下游的两条重要信号通路，可调节包括增殖、分化、凋亡和迁移等多种细胞过程，其异常激活可导致肿瘤血管生成、肿瘤细胞过度增殖和发生耐药，进而导致恶性转化及肿瘤进展［14-15］。在NSCLC中，PI3K/AKT信号通路可被多种因素激活，如上游EGFR、VEGFR或PI3K/AKT突变或扩增［16］。SATO等［17］通过体外研究发现，阻断PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路有望克服NSCLC细胞对吉非替尼的耐药。安罗替尼作为多靶点的抗血管生成药物，多项研究亦显示其可通过抑制PI3K/AKT和MEK/ERK等细胞生存信号通路的激活而在多种实体瘤中发挥抑制肿瘤细胞生长的作用［18-21］。在本研究中，吉非替尼单药处理后PC9/GR细胞中p-AKT和p-ERK1/2表达水平无显著变化，但安罗替尼单药处理后PC9/GR细胞中p-AKT和p-ERK1/2表达水平下调，而安罗替尼联合吉非替尼处理后的PC9/GR细胞中p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表达水平较各单药组明显下调，提示安罗替尼联合吉非替尼可通过抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路中p-AKT和p-ERK1/2蛋白的活化水平抑制肿瘤细胞增殖，同时增强细胞对吉非替尼的敏感性，进而逆转吉非替尼耐药，这可能是两药表现出协同抗肿瘤效应的重要机制之一。

综上所述，安罗替尼联合吉非替尼对非小细胞肺癌PC9/GR细胞具有良好的协同抗增殖作用，安罗替尼可能增强EGFR-TKIs继发性耐药NSCLC细胞株对吉非替尼的敏感性，逆转吉非替尼耐药，提高药物的抗肿瘤活性，其协同作用机制可能与诱导细胞周期阻滞和下调p-AKT和p-ERK1/2蛋白的活化水平有关。本研究为EGFR-TKIs继发性耐药患者的治疗提供了新的治疗思路及参考依据。但EGFR-TKIs继发性耐药的机制复杂，本研究为体外实验，且未对耐药细胞株进行耐药机制检测，后续研究仍需对耐药机制作进一步研究，并完善动物实验加以验证。