光动力杀菌机制及在食品应用中的优势与不足

孟媛媛，刘海泉,2,3，潘迎捷,2,3，赵 勇,2,3,

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；

2.农业农村部（上海）水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海 201306；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

光动力杀菌（Photodynamic inactivation technology，PDI）是一种新型的非热杀菌技术，是利用光激活光敏剂产生的活性氧物质引起微生物死亡的杀菌技术[1]。有研究表明PDI可以有效杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等细菌[2]，对黑曲霉、黄曲霉、灰黄青霉和白色念珠菌等真菌杀菌效果显著[3]。同时也可以杀灭杜兰病毒[4]、 H5N8禽流感病毒[5]等。此外，其最大的优点是不易使有害微生物产生耐受性[6-10]。

在食品生产与加工环节中存在广谱杀菌性抗生素投入过量的情况，微生物抗生素耐药性已是21世纪全球范围内令人关注的公共卫生问题之一，不仅在医疗领域受到重视，在食品卫生安全中也是重点关注的问题[11-14]。抗生素不能在原有的杀菌时间或药物浓度下有效的完全清除病原体，是细菌耐受性的具体表型之一[15]。有害微生物抗生素耐受性的增强迫切需要找到其他新型安全的杀菌技术，而光动力杀菌技术既可以达到杀灭有害微生物的效果，同时不易使其产生耐受性。这一特性也使得PDI在医疗领域的研究和应用非常广泛，但是在食品的应用仍处于研究阶段。本文系统阐述了PDI不易产生耐受性的杀菌机制，PDI的影响因素以及其在食品中的研究进展，就PDI在食品研究中给出新见解，以期为其在食品领域的进一步应用提供依据。

1 PDI的杀菌机制

PDI作为一种不易产生耐受性的杀菌技术，其原理见图1所示。当特定波长的光照射到微生物上时，光的一部分会被光敏剂吸收，光敏剂会被激发出更高的能量形成激发单重态（1PS*），此状态不稳定会返回基态或形成稳定的激发三重态（3PS*），激发三重态会与细胞内底物特别是氧发生反应，传递能量给氧分子，随后产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。ROS是PDI起到杀菌作用的有效成分，会产生氧化应激，可以同时作用多种靶点，包括破坏微生物的细胞壁、细胞膜等，对细胞的遗传物质DNA产生负面影响，干扰蛋白质的正常表达等多种方式协同造成致病菌死亡[6,8]。在抗生素作用过程中，细菌可以通过发生靶点突变，使得抗生素不易与细菌结合产生抗生素耐受[16]；但在PDI作用过程中，触发的难以被细菌抵消的多种杀菌机制大部分是致命的，而不仅仅是抑制生长，细菌在短时间内被完全杀死，无法同时产生多重抵抗机制，此原理使得微生物不易产生耐受性[1,7,17]。研究表明PDI可以治疗万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌引起的感染，杀灭铜绿假单胞菌等耐药细菌[18]。

1.1 对细胞形态及结构影响

细胞壁可以维持微生物外形、减少机械和渗透损伤，并且协助细胞的生长和运动，防止大分子入侵[19]。有研究表明细菌经过光敏剂处理后，在黑暗和有光照射的条件下经扫描电镜观察显示，光照后的细菌形态、大小发生变化，细胞壁出现损伤的迹象，细胞质发生流失，细菌最终死亡。但黑暗条件下的细菌形态规则，无显著变化[9,20-21]。Alex等[22]研究结果显示经玫瑰红和赤藓红介导LED光照射金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和海氏肠球菌的表面张力发生变化，细菌的表面疏水性降低，金黄色葡萄球菌表面转移电子能力减弱，大肠杆菌非极性组分增加。研究者认为，PDI改变细菌表面的理化性质，干扰了脂质双分子层的两亲特性，是引起细菌死亡的原因之一。

1.2 对细胞膜的影响

细胞膜的渗透性屏障对细胞进行能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞免疫和代谢调控等功能是必不可少的[19]。Gong等[23]研究表明姜黄素介导的PDI破坏了假单胞菌的细胞膜完整性，增加了细胞膜的通透性。膜的通透性增加可能会导致细胞内物质泄漏，破坏细菌的正常生理功能。因此PDI对细菌外膜蛋白的光损伤或降解作用可能是抑制细菌生长的原因之一。Gao等[24]使用GLSM联合PI染色证实经PDI后，牡蛎中的大肠杆菌DH5α的膜通透性增强，这可能是细胞内产生的ROS损害膜的通透性，最终导致细菌死亡。Alex等[22]实验结果显示，PDI处理后细菌的细胞质膜受损，引起了胞内钾的泄漏。经PDI后的细胞内ROS过度积累是细胞死亡的直接或间接原因，过量的ROS会破坏细胞膜、细胞质膜和核膜，是引起致病菌死亡的原因之一[23]。

1.3 对DNA的影响

DNA是细菌在细胞物质合成和遗传过程中具有重要作用的遗传信息载体，是细菌正常生理活动和繁殖的基础。一旦DNA被破坏，细菌就不能正常生长[19]。有研究显示，经PDI处理单增李斯特菌的DNA发生巨大损失[22]。光敏剂经过光激发产生的活性氧与核酸发生静电相互作用在鸟嘌呤残基上引起DNA裂解。同时，有研究报道经PDI处理后，细菌eDNA中的鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）残基明显减少，说明PDI可能是通过破坏DNA的组成成分，从而降解DNA链[6]。

1.4 对蛋白质的影响

PDI产生的ROS可以作用微生物的蛋白质，影响其各项功能表达。如Chen等[9]研究姜黄素介导蓝色LED光照射副溶血性弧菌，研究结果显示细菌的部分蛋白质出现高降解，蛋白质是姜黄素介导PDI的脆弱靶点之一。ROS可以与蛋白质中的各种氨基酸残基反应，导致组氨酸残基的丢失。特别是硫氨基酸、半胱氨酸和蛋氨酸容易受到影响[9]。

2 影响PDI效果的因素

PDI的三个基本要素是光源、光敏剂与氧气[22]，它们可能会影响PDI的杀菌效果。

2.1 光源

光源的波长与PDI杀菌成功与否有着直接的关系。在PDI研究中主要考虑的是光源的发射波长以及光敏剂的吸收波长[6]。在光源选择上，一般有宽带光（发光二极管）、激光等。发光二极管（LED）是利用波长在200～780 nm之间的光能。波长范围为200～280 nm（UV-C），280～320 nm（UV-B），320～400 nm（UV-A）和 400～470 nm（蓝光）均具有抗菌功效[24]。在水消毒领域，200～280 nm（UV-C）波长范围内的光源抗菌效果较佳；在食品加工领域中波长为365、395和455 nm发射光的应用广泛；在光疗、染色和涂层固化以及油墨固化等领域常使用红光和红外（630～1000 nm）[25]。

激光也可以用来激活光敏剂，包括CO2激光、Nd:YAG激光、Er:YAG 激光、半导体激光、强脉冲光等，具有操作简便、治疗快速、创伤小、恢复期短等优点，常在肿瘤、真菌类疾病治疗和美容医疗领域中应用[26-28]。与激光相比，发光二极管（LED）的优势在于操作简单，经济实用，并且单色激光技术还未被证明比宽带光更适合PDI应用[29]。

2.2 光敏剂

光敏剂是一种存在于细胞内的物质，随着高效光敏剂研究的不断进步和发展，至今已知的具有光敏特性的化合物有400多种，包括染料、化学物质和许多天然物质。在PDI中，最常用的染料包括如亚甲基蓝和甲苯胺蓝聚赖氨酸、血卟啉和玫瑰红等[30]。光敏剂可以显著提高PDI的杀菌效率，因此现阶段大多数研究主要集中于发现或合成更好的光敏剂[6]。

2.2.1 内源性光敏剂 内源性光敏剂广泛存在于一些病原微生物中，LED光杀菌的原理就是通过激活细菌细胞壁中存在的内源性光敏剂卟啉，产生活性氧最终导致细胞死亡[26]。同时，在部分食品中也含有光敏剂，如牛奶中含有核黄素、原卟啉、四吡咯和叶绿素等光敏剂[31]。绿色蔬菜和水果中也含有丰富的核黄素[32]。内源性光敏剂的优点是安全无毒，当需要缓慢、渐进的效果时，利用内源性光敏剂是一种理想的选择。例如家用冰箱、超市货架和食品储藏室基本具备持续的光源，光源激活内源性光敏剂起到缓慢且稳定的杀菌效果[6]。

2.2.2 外源性光敏剂 当未添加外源性光敏剂时，往往要照射7 h以上才能达到完全灭菌的效果，而添加适量光敏剂后通常只需10～20 min[33]。因此，在需要迅速杀菌或内源性光敏剂杀菌效果低于预期时，可以添加外源性光敏剂缩短杀菌时间，增强杀菌效果。现阶段，广泛使用的光敏剂有人工合成和天然光敏剂，人工合成光敏剂中常见的有卟啉衍生物、氯丁和酞菁衍生物等[6]。卟啉衍生物是指通过化学修饰使卟啉能够合理的转化为具有优越光活性的各种衍生物，如二氢卟吩[34-35]。酞菁衍生物是将四个苯环或萘环连接到卟啉环的四个吡咯β位上，再把meso-H对应的C转换为N形成酞菁，在波长750～900 nm范围内光吸收较强[36]。这些光敏剂均具有较好的杀菌效果[37-38]。

天然光敏剂大多数是从天然植物中提取出。金丝桃素是一种天然活性成分，可以从贯叶连翘中分离出来，具有抗抑郁、抗肿瘤和抗病毒活性。因其无毒、无遗传毒性作用，是应用中的最佳候选光敏剂[9,37]。姜黄素是一种从姜黄中分离出来的天然多酚类化合物，具有抗病毒、抗氧化、抗微生物和抗炎作用，在PDI中作为光敏剂应用广泛[35]。此外，其他常用于PDI中的天然光敏剂有玫瑰红[39]、赤藓红[40]、竹红菌素[41]、叶绿素钠镁[42]等。

2.3 氧气

PDI中最终导致细胞死亡的有效物质是活性氧物质[9]。活性氧是在有氧存在的条件下，光敏剂与其相邻分子发生碰撞通过如下两种方式产生的。第一种方式是I型光化学反应，受激发的光敏剂从系统组件中提取出一个电子或氢原子，形成了两个自由基，即光敏剂自由基和底物自由基。如果系统中存在氧，则光敏剂自由基可将新获得的电子转移到氧上，形成超氧自由基，如过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基，光敏剂返回到其基态。在这一过程中，有可能光敏剂被消耗而不被再生。另一种方式是II型光化学反应，光敏剂与氧分子发生碰撞，生成单线态氧，在这种途径中光敏剂不会消失[25]。单线态氧在水溶液中存在时间不超过4 μs，扩散范围约为125 nm。单线态氧在其回到基态前，有机会与扩散范围内的任何生物分子发生反应[43]。Quiroga等[44]添加氧化清除剂（氩、叠氮化钠）到卟啉光敏剂介导PDI处理白色念珠菌，实验结果显示在低氧含氩条件下，卟啉光敏剂的杀菌活性显著降低，说明氧在PDI中起到重要作用；叠氮化钠作为单线态氧的猝灭剂，当叠氮化钠存在时，白色念珠菌受到高度保护未受到光动力的影响；实验结果表明杀灭白色念珠菌的主要物质是单线态氧，说明单线态氧是参与细胞损伤的主要活性物质。

这两条途径中哪一条是主导的，取决于细胞内分子氧和光敏剂含量的水平。同时，氧和光敏剂这两种因素会直接影响到单线态氧和氧自由基的产率。当氧浓度过低或缺氧时，活性氧物质产率过低甚至不发生光化学反应，PDI效果较差或者无效果。产单线态氧高的光敏剂PDI效果更佳[45-46]。在大部分食品贮藏中，由于氧气是较难控制的，至今氧对PDI影响的相关研究报道较少。因此，PDI的三个基本要素中，每一个要素都可以不同程度地控制，但光通常是最易调节的，氧气是最难控制的，光敏剂则是最大限度地提高PDI处理成功的关键[9]。

3 PDI在食品中的应用及其优势与不足

在体外PDI对致病菌的作用效果显著的基础上，研究者开始探究该技术在食品中的应用潜力。对不同食品的研究见表1所示。在应用研究中，有利用部分食品含有的内源性光敏剂直接光照后达到杀菌效果，或添加外源性光敏剂介导PDI。近年来，也有研究者通过复合PDI和气调包装技术达到更佳的防腐保鲜效果。

表1 光动力杀菌技术在食品中的应用研究Table 1 Research of photodynamic inactivation technology in foods

部分食品中含有丰富的光敏剂，如牛奶中含有核黄素、原卟啉、四吡咯和叶绿素等，可以通过直接光照达到杀菌效果。Srimagal等[47]研究蓝色LED光处理对牛奶中大肠杆菌杀菌的影响，实验结果显示，不同条件下大肠杆菌数均减少，其中波长405 nm，光照60 min可以减少大肠杆菌5.27 lg CFU/mL。在室温和冷藏条件下，波长405 nm、光照37.83 min的LED光处理的牛奶，牛奶的货架期分别为19 h和9 d。与普通巴氏杀菌牛奶相比，LED光处理的牛奶具有更长的保质期。然而光只能照射到物体的表面，不能穿透食品内部。大量的研究者通过在食品表面涂抹或喷淋光敏剂增强PDI杀菌效果。因此，开发新型光敏剂增强杀菌效果的研究一直是热点内容。

随着人们对健康食品、绿色食品的追求以及食用安全性的考虑，引领了研究者对天然光敏剂的开发趋势，出现了姜黄素、核黄素、叶绿素等安全无毒的天然光敏剂。姜黄素作为一种天然性、安全性高的食品级光敏剂，在PDI中更易得到消费者的接受，因此以姜黄素介导PDI在食品中的研究非常广泛。Corrêa 等[48]使用浓度 40 μmol/L 的姜黄素，波长450 nm，光剂量15 J/cm2的LED光照射牛肉、鸡肉和猪肉，金黄色葡萄球菌数量分别减少1.5、1.4和0.6 lg CFU/mL；使用浓度80 μmol/L姜黄素和光剂量10 J/cm2照射苹果，发现金黄色葡萄球菌数量减少2 lg CFU/mL。但在实际应用中，天然光敏剂由于疏水性较强导致其有效性受到限制，研究者们通过将光敏剂纳米级化有效地解决了这一难题，改善了光敏剂的化学效率，增强PDI杀菌效率和应用潜力。Duse等[49]将姜黄素与壳聚糖纳米粒子结合改善姜黄素的溶解度，使光敏剂可以更好地在PDI中发挥作用。然而，大多数天然光敏剂是由植物中提取出常常带有颜色，这可能会影响到产品的感官品质，因此在应用研究中建议首选与食品相同颜色的光敏剂。此外，可以开发无色无味的天然光敏剂，这将是一项新的挑战。

近年来，也有研究者复合PDI与其它保鲜技术，如光敏剂与气调保鲜联合达到更好的杀菌、保鲜效果。周阿容等[50]通过复合PDI与真空包装有效地解决了鲜莲在流通过程中因产酸产气微生物的生长繁殖导致的酸败、胀袋现象；研究者发现浓度为1.5 mmol/L姜黄素，光照45 min有良好的灭菌效果，抑菌率达99%，并且不影响鲜莲的水分含量，可以最大程度地保持鲜莲的风味，有助于莲子的流通销售，并有效地延长货架期。

在PDI杀菌过程中的有效物质是单线态氧或自由基物质等活性氧物质，而活性氧在破坏微生物的细胞壁、遗传物质和干扰蛋白质的正常表达的同时，是否会对食品中包含的蛋白质、维生素等成分产生影响的研究暂未见报道，因此研究者们应关注PDI杀菌过程中食品自身营养成分的变化。有研究表明活性氧物质可以通过诱导腺苷一磷酸活化蛋白激酶途径增加肉的嫩度，加速糖酵解使得肉的保水性下降，清除活性氧后，牦牛肉的保水性显著提高[51]。也有研究显示PDI处理可以有效地延缓哈密瓜褐变速率，并保持新切哈密瓜的光度、牢固度、含水量和可溶性固体含量[52]。至今活性氧物质对不同食品品质的影响研究结果不同, 探究活性氧杀菌对不同种类食品品质的影响，将有助于将PDI应用到更适宜的食品种类中。因此，研究者应更加关注PDI对食品品质的影响和变化。其次，单线态氧的寿命短，食品所处的环境复杂，精准测定PDI过程中起到作用的活性氧含量也是一项巨大的挑战。

综上所述，研究者们应选择杀菌效果佳，对食品营养成分及品质无影响的活性氧浓度，确定最佳的光敏剂种类及剂量。从光源的选择和光敏剂的种类及剂量控制，以及活性氧含量等多个角度考虑，开发出杀菌效果佳，对食品无影响，并且在实际应用中成本低效率高的PDI光源和光敏剂，以及探究光敏剂种类和剂量的最佳使用范围。这对PDI技术在食品工业领域的实际应用具有重要意义。

4 总结与展望

在食品质量控制中，抗生素是现阶段控制有害微生物的重要手段之一。但由于有害微生物的耐药性，全球范围内的科研人员投入大量的精力和物力开发新型抗生素，但细菌和病毒等有害微生物仍然在不断的突变中，给食品等各领域造成的经济损失非常巨大。因此，开发对耐药机制不敏感的杀菌技术是维护食品质量安全的必然趋势。PDI作为一项成熟的技术，在医疗和临床中的应用非常广泛，但在食品质量安全领域的应用仍然处于研究阶段。PDI杀菌效果佳、操作简单、安全环保，在食品领域中具有巨大的应用潜力[62-63]。

已有研究者对该技术作用食品防腐的研究进行报道，但PDI在奶制品、肉制品和果蔬品等不同类型的食品中杀菌效果不同，因此加深PDI在不同食品杀菌效果差异比较，这有助于PDI在适宜的食品领域中发挥优势。此外，PDI对食品品质影响的研究仍处于探究阶段，对食品营养成分影响的研究处于空白阶段。因此，PDI在食品基质的适应性和影响研究，对PDI技术商用化具有重要意义。PDI也可与其它防腐技术相结合，如核黄素与天然抗菌物质壳聚糖复合制备抗菌包装材料，初期研究结果显示二者结合抗菌效果佳[64]。PDI不仅可以直接作用到食品杀菌中，也可以用于配送设备、厨房设备或包装材料的去污杀菌。并且，PDI还可以应用到水产养殖中，将光敏剂加入水产品养殖池塘后经过照射达到杀菌效果，替代生产养殖中的抗生素，具有长期应用潜力。这不仅对有助于水产养殖的绿色生态防控，还能从源头保证食品的质量和安全。

综上所述，有害微生物作为食品质量安全问题的威胁之一，尤其对有低温杀菌需求的食品而言，PDI是一项优良选择。PDI作为一种有新型非热杀菌技术，开拓了控制食品有害微生物的途径，对维护食品质量安全问题具有重大意义。