动物源性降糖肽的研究进展

马昕悦，刘鸣雨，李 熔，薛 勇,

（1.国家粮食产业（青稞深加工）技术创新中心，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.国家果蔬工程技术加工中心，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷或其作用受损，或两者兼有引起。2019年全球约有4.63亿糖尿病人，其中90%为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。T2DM 在中国的发病率较高[2]，已成为我国主要的公共卫生问题之一。糖尿病会引起许多并发症，如引发各种感染，诱发多器官功能障碍综合征[3]、脊髓损伤[4]，还会引起脂代谢紊乱，增加脑卒中[5]、眼底视网膜病变[6]的风险。此外，T2DM还会造成抑郁、焦虑等心理疾病[7]。然而糖尿病暂无根治方法，患者需通过长期服药来控制[8]。近年来随着食源性功能肽辅助治疗慢性病的逐渐兴起，大量研究发现动物食品中广泛存在降糖肽，这些肽未来可能用于糖尿病的辅助治疗。基于此，本文对动物源性降糖肽的现有成果进行综述，为预防和辅助治疗糖尿病及相关功能性食品的开发提供理论依据。

1 食源性降糖肽

1.1 食源性降糖肽靶点

降糖肽主要的作用机理是抑制糖代谢过程中的关键酶，其中α-葡萄糖苷酶和DPP-4一直是关注的焦点。食源性活性肽主要通过氢键、极性和疏水性作用，与酶催化位点上的氨基酸结合，从而产生竞争性抑制。α-葡萄糖苷酶可将食物中的大分子碳水化合物分解成单糖，单糖会进入血液使血糖升高，故α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制相应酶的活性，延缓碳水化合物吸收，继而减少葡萄糖的产生，达到降低餐后血糖的目的[9]。此外，肠促胰素分为胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP），两者均能作用于胰岛β细胞，促进胰岛素分泌、胰岛β细胞再生和增殖[10]。而GLP-1会快速被机体中广泛存在的DPP-4降解，半衰期仅为2 min[11]。因此，抑制DPP-4的活性可延缓GLP-1的降解，继而改善胰岛功能。对DPP-4的抑制主要通过活性肽与其催化活性位点D192、E192和R253结合，使酶结构发生改变，无法作用于GIP和GLP-1的二肽尾，从而提高内源性GLP-1和GIP水平，最终达到降低血糖的效果[9]。

1.2 食源性肽制备方法

食源性降糖肽的制备方法有酶解法、微生物发酵法和人工合成法[12]，其中酶解法应用最为广泛。酶的专一性强，故水解时应注意选择适当种类的酶，一般选择一种酶进行水解或多种酶复合水解。常用的有中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶等。此外，酶活性受环境条件影响较大，若要达到最佳的酶解效果，需将温度和pH控制为最适条件。其他反应条件如底物浓度、酶浓度、酶解时间、超声辅助提取时间等会对多肽得率产生影响，由于酶解对象不同，这些条件的最佳值需要通过实验优化得到。酶解过程中蛋白质水解为短肽链，消化率提高，从而最大程度地保留食品的营养价值，同时，酶解法具有反应条件温和、无不良副反应、反应进程易控制等优点[13]，故该方法在食源性肽的工业化生产中有良好应用前景。

1.3 食源性肽降糖效果评价方法

评价食源性降糖肽降糖效果的常用方法有体外验证、体内验证和分子对接等。体外验证一般选用α-葡萄糖苷酶、DPP-4试剂盒[14]。试剂盒工作原理多遵循酶联免疫吸附测定法。微孔板上包被着纯化的抗体，样品被加入微孔后，与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5',-tetramethylbenzidine，TMB）显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品浓度呈正相关，根据试剂盒检测结果可判断样品的降糖效果[15]。

体内验证是以糖尿病大鼠、小鼠或者人为研究对象，采用口服给药的方法，检验降糖肽的有效性[16-17]。动物实验一般先建立糖尿病小鼠模型，经过一定时间的灌胃给药后，取血清对血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、C肽等指标进行检测[14]。人群研究通常招募糖尿病患者并将其随机分组，分别给予降糖肽和安慰剂，对比不同组糖代谢指标的差异。例如，有研究探究海洋鱼胶原蛋白肽（marine collagen peptides，MCPs）对2型糖尿病患者的治疗效果，实验招募了100名糖尿病患者，他们被随机分为治疗组和对照组。治疗组连续3个月每天额外服用13 g MCPs，安慰剂组不服用。在治疗前、治疗后1.5和3个月采集血样，结果显示，治疗组患者的空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素等指标均有明显改善，说明了MCPs有利于调节糖尿病患者的糖代谢[18]。

分子对接技术筛选速度快，精度高，常用于降糖药物的筛选。分子对接方法可以从天然产物小分子化合物库中自动筛选出与靶标蛋白高度结合的天然小分子[19]。例如，在研究生物活性肽与α-葡萄糖苷酶之间的结合方式时，从RCSB Protein Data Bank数据库下载α-葡萄糖苷酶三维结构文件，利用Discovery Studio软件包绘制多肽的三维结构，并对多肽进行能量最小化处理。然后利用Discovery Studio软件处理α-葡萄糖苷酶分子，去除所有水分子，并给酶分子加氢。处理后的α-葡萄糖苷酶分子分别与多肽进行分子对接，从而筛选出结合效果好的肽，即为潜在的抑制肽[20]。

2 动物源性降糖肽

2.1 来源于畜禽肉的降糖肽

畜禽肉是优质的动物性蛋白，其中猪肉和鸡肉蛋白是降糖肽的潜在来源。Kęska等[21]通过胃肠道酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶）水解猪肉蛋白，并对释放的短肽进行分析，发现所得序列以二肽为主，其中GF、MW、MF、PF、PW活性指数最高，表明F和W两个疏水芳香氨基酸在抑制DPP-4活性上起着重要作用。已有资料表明，在食物蛋白衍生出的短肽中，二肽对DPP-4的抑制作用比三肽或氨基酸更明显[22]。本研究的结果支持二肽对DPP-4抑制作用较强，同时研究要重点关注水解产物中含F或W的二肽。机体胃肠道环境比较复杂，体外实验的结果并不能简单推及到体内。Sim等[23]给2型糖尿病KKAy小鼠和GK大鼠口服了一种以蛋白质和肽为主要成分的液态商业鸡肉提取物。8周后测定发现，糖尿病动物的血糖水平显著降低，而血液胰岛素水平没有明显变化，进一步分子层面的结果发现细胞质膜葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）和胞浆酪氨酸磷酸化的胰岛素受体底物-1（IRS-1）显著增加。可见鸡肉提取物虽然不能改变胰岛素的分泌情况，但能有效减轻胰岛素抵抗，对2型糖尿病有良好的控制作用。目前从畜禽肉中水解得到降糖肽的研究相对有限，这些水解肽在体内的稳定性和降糖效果有待于进一步研究。

2.2 来源于鱼类的降糖肽

鱼类是人体获取动物性蛋白的主要来源之一，流行病学调查资料显示，适量摄入鱼类能有效控制餐后血糖，降低罹患糖尿病的风险，鱼类蛋白经消化产生的水解肽可能是发挥降糖作用的物质之一[24]。

近年来，鱼肉中的降糖肽逐渐被发掘，其中鳟鱼、鲈鱼、鲢鱼、鲑鱼、方鲷、大比目鱼、罗非鱼等普遍存在降糖肽。Ketnawa等[25]用碱性蛋白酶水解鳟鱼骨架并对蛋白水解物进行体外测定，发现水解物对DPP-4的抑制活性为40.45%±0.48%，IC50为4.80±0.60 mg/mL。研究还发现，低分子量肽段比例增加会导致更高的DPP-4抑制活性，可见多肽分子量大小和DPP-4有关，但作者并未对具体多肽对DPP-4的抑制机制进行进一步探究。Wang等[26]将大口黑鲈蛋白模拟胃肠水解，构建水解多肽数据库，进一步采用分子对接技术筛选和DPP-4结合能力最强的肽段。结果发现6种三肽对DPP-4表现较强的抑制活性，其中ICY活性最强（IC50=0.73 mmol/L），它能与DPP-4之间形成氢键、π键和静电相互作用，并在DPP-4高度疏水的S1位点形成疏水相互作用。分子对接技术的引入，除了能明确多肽和关键蛋白的结合能力，还能进一步预测结合位点和机理，同时能够明确发挥关键作用的结构特征。Zhang等[27]借助生物信息学技术，鉴定、分离、合成了鲢鱼蛋白水解产物中有效的DPP-4抑制肽。其中中性蛋白酶产生的水解产物具有最大的DPP-4抑制作用（IC50=1.12 mg/mL），鉴定出的四种DPP-4抑制肽分别为AGPPGPSG、APGPAGP、LPIIDI和ALAPSTM。以往研究表明，肽抑制剂N端三肽序列决定其与DPP-4的结合，而P位于2位的序列由于其底物样结构，通常是DPP-4的竞争性抑制剂[28-29]。对本研究鉴定出的降糖肽的体外实验表明，P位于第二位的LPIIDI和APGPAGP有更高的DPP-4抑制活性，IC50分别为105.44和229.14 μmol/L，结果与既往报道相符。若某些氨基酸具有特定的活性，则含有此类残基的短肽也可能具有类似的作用，比如GP和Q能够有效促进GLP-1分泌[30]，VLGP也被证实具有 DPP-4抑制活性[31]。Harnedy等[32]使用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解鲑鱼明胶，其中AVLGPK和AVLGPQ中均含有VLGP的序列，体外实验表明二者均能抑制DPP-4活性。

以上研究表明鱼类的蛋白水解产物在生物体外具有良好的降糖效果，然而生物体内不同的环境会影响降糖肽的作用方式，可能导致降糖效果的改变，因此有必要进行细胞实验或动物实验的进一步验证。Harnedy等[33]用碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解方鲷蛋白，从水解物中鉴定出了22条DPP-4抑制肽和15条促胰岛素肽，进一步通过体外实验和细胞实验对其评估。其中DPP-4抑制肽IPVDM在体外常规实验中 IC50为 21.72±1.08 μmol/L，在 Caco-2 细胞实验中 IC50为 44.26±0.65 μmol/L，均显示出较强的DPP-4抑制活性，说明该降糖肽在细胞内确实能够发挥抑制作用。此外，还发现IPVDM可刺激胰腺BRIN-BD11细胞的胰岛素分泌活性。综上可知，IPVDM能以完整的形式穿越人上皮细胞膜，并通过多种机制介导降糖作用。多肽在胃肠道系统里面可能会进一步分解，细胞试验的结果并不能简单推及到体内。Wang等[34]对大比目鱼皮肤水解液和罗非鱼皮肤明胶水解液进行体外DPP-4抑制活性和大鼠体内抗高血糖效果的研究，发现两种水解液均具有较好的降糖活性，大鼠DPP-4的活性显著降低，GLP-1的分泌明显增加，说明该蛋白水解肽在体内仍能发挥明显的DPP-4抑制效果。有研究进一步采用人群干预实验探究鳕鱼蛋白水解物的降糖效果，结果发现最高剂量的水解物与低剂量的相比，具有更好的降低餐后血糖水平的效果[35]。目前关于鱼肉降糖肽的研究是热点，但是多半停留在体外实验的阶段，在体内能否继续发挥降糖作用是限制其应用和推广的关键因素。另外，目前关于鱼肉降糖肽通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性来发挥降糖作用的研究较少。

2.3 来源于血液的降糖肽

动物血液是畜禽屠宰加工过程中的主要副产品，目前未能被充分利用，浪费较为严重。动物血液中含有丰富的蛋白质和其他营养素，已有的研究表明驼血、猪血、牛血可作为降糖肽的开发来源。刘丽君[36]利用酶解法制备驼血多肽，结果表明风味蛋白酶酶解4 h，酶浓度为5 mg/100 mg，料液比为1:6时，驼血酶解产物的α-淀粉酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性最高。进一步分离纯化发现多肽YPGETR的α-淀粉酶抑制率最高（66.03%），YPWTRR 的α-葡萄糖苷酶抑制率最高（90.86%），说明驼血多肽具有潜在降糖作用。Lafarga等[37]利用PeptideCutter软件对猪和牛血液中已知序列的蛋白成分进行模拟酶切，在猪和牛血清白蛋白中得到了一种新的DPP-4抑制肽PPL，体外实验表明其IC50为390.14±44.3 μmol/L。此外，在牛血红蛋白亚基α中还鉴定出了多种DPP-4抑制肽 VA、KA、LA、FP、PA、LP、LL、HA，这些肽此前已被证明具有降糖活性。计算机模拟酶切避免了传统酶解费时且易受环境干扰的缺陷，能高效地鉴定并获得降糖肽序列，这为降糖肽的开发提供了新方法，但这些肽必须在特定的位点被酶切下，才能正常发挥降糖活性，目前的酶解工艺还难以实现精准。

2.4 来源于乳类的降糖肽

乳类是一种营养品质高的蛋白质，在乳中提取降糖肽作为功能性食品成分，是当前的研究热点之一。诸多研究表明，骆驼乳、牛乳、羊乳等乳类均具有降糖作用。Korish等[38]给链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠持续口服骆驼乳或牛乳，干预8周后二者均可使糖尿病大鼠体重增加，血糖水平下降，葡萄糖耐受性改善。可见骆驼乳和牛乳经消化液酶解后的产物很可能含有降糖活性肽。Nongonierma等[39]研究了骆驼乳蛋白的水解物，在水解产物中检测到来自于α-乳清蛋白的DPP-4抑制肽LAHKPL和ILDKEGIDY，以及来自于β-酪蛋白的DPP-4抑制肽VPV、YPI和 VPF，三者的IC50值分别为 6.6±0.5、35.0±2.0、55.1±5.8 μmol/L，表明骆驼乳中确实含有降糖肽。此外，骆驼乳中分离出的VPV是迄今为止发现的第二强DPP-4抑制肽，仅次于抑二肽素A，这提示骆驼乳可能具有良好的降糖作用。牛乳中的乳清中富含α-乳白蛋白，甲承立[40]对α-乳白蛋白水解产物进行研究，发现从水解物中分离出的活性肽LDQWLCEKL具有较高的DPP-4抑制活性，IC50为131.07 μmol/L，并能促进GLP-1的分泌和表达，可见牛乳也能水解产生降糖肽。羊乳作为生活中常见的乳类之一，逐渐引起研究者的关注。Jan等[41]使用胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶水解生羊奶和煮羊奶中的酪蛋白，并对水解产物进行α-淀粉酶抑制实验。结果显示，与煮沸羊乳酪蛋白水解物相比，不同酶解方式下生羊乳酪蛋白水解物对α-淀粉酶抑制效果均较强，提示食物热处理引起的蛋白变性可能会影响到其水解多肽的功能。

2.5 来源于蛋类的降糖肽

蛋类也是日常生活中蛋白质的主要来源，研究者对其降糖肽的研究主要集中于对不同部位蛋白的降糖效果进行评价。Yu等[42]使用碱性蛋白酶对蛋清蛋白进行酶解，并测定产物中多肽的抑制活性，体外实验发现RVPSLM、TPSPR、DLQGK、AGLAPY、RVPSL、DHPFLF、HAEIN、QIGLFα-葡萄糖苷酶抑制活性较强。其中，RVPSLM和TPSPR活性较高，IC50值分别为23.07和40.02 μmol/L。Zambrowicz等[43]用亚洲南瓜蛋白酶制备蛋黄蛋白副产物水解液，发现LAPSLPGKPKPD具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。Zambrowicz等[44]使用胃蛋白酶水解蛋黄蛋白，发现多肽YINQMPQKSRE、YINQMPQKSREA、VTGRFAGHPAAQ兼有抑制α-葡萄糖苷酶和DPP-4的效果，可见卵黄蛋白也可能是降糖肽的来源之一。综上可知，蛋清和蛋黄蛋白中均可制备降糖肽，但是目前的研究并未深入解析潜在降糖肽和α-葡萄糖苷酶、DPP-4分子作用机制，更未评价其在体内降糖效果。蛋类相对于其他动物性食物蛋白，相对便宜、易得，深入解析降糖作用机理和明确体内降糖效果，有助于基于蛋类的功能性食品的开发。

2.6 来源于其他动物性食物的降糖肽

动物源食物较为丰富，除了常见的畜禽、鱼类、蛋类及其制品，蛋白质含量丰富的海产品如虾、海参等也是研究降糖肽的热点。Ji等[45]对南极磷虾蛋白水解物的DPP-4体外抑制活性进行了评估，发现KVEPLP和PAL具有对DPP-4的抑制活性，IC50分别为 0.73±0.04 和 0.88±0.03 mg/mL，表明南极磷虾蛋白水解物具有降糖的潜力。王美华等[46]研究了海参肽对正常小鼠糖耐量水平的影响，以及对皮下注射肾上腺素所致应激性高血糖模型小鼠血糖水平的调节作用。与模型组相比，海参肽能显著降低正常小鼠糖耐量试验中的血糖值，并能显著降低肾上腺素所致高血糖小鼠的血糖值。此外，我国有传统食用习惯的动物性食物如蚕蛹、蜂王浆、马鹿茸，也被证实具有良好的降糖效果。张玉等[47]使用酸性蛋白酶酶解蚕蛹蛋白粉，并研究不同剂量蚕蛹蛋白酶解肽对糖尿病小鼠的影响。连续给药5周后，发现蚕蛹蛋白酶解肽可明显降低小鼠糖化血清蛋白含量，改善糖尿病小鼠的心脏指数、肾脏指数和肝脏指数。朱作艺等[48]以酸性蛋白酶水解蜂王浆粗蛋白，测定结果显示蜂王浆蛋白肽对α-葡萄糖苷酶的IC50为6.94 mg/mL，说明蜂王浆蛋白肽具有一定的降糖活性。包美丽[49]采用双酶法（碱性蛋白酶和风味蛋白酶）以马鹿茸为原料制备降血糖肽。当水解终产物质量浓度为3 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率可达94.09%，IC50为1.82 mg/mL。以上研究表明降糖肽也可能广泛存在于这些动物性食品中，研究中不仅要关注主要动物性食物，传统功能性食材也值得探讨研究。文中涉及到的动物源性降糖肽总结如表1。

表1 动物源性降糖肽Table 1 Animal-derived hypoglycemic peptides

3 结论与展望

随着营养与健康的观念逐渐深入人心，消费者越来越认同这样一个观点：食物不仅提供营养，同时也提供许多有益身体健康的功能成分。许多研究者已从体外测定、生物信息学技术、细胞实验、动物实验等多个方面证实了动物食品中广泛存在降糖活性肽，说明动物源性降糖肽具有很大的研究价值。目前，血液源降糖肽的数据较少，说明血液源降糖肽可能还处在未被充分开发的阶段，值得持续关注。来源于中国传统食品的降糖肽为商业化产品的开发提供了一条新思路：我国糖尿病患者数量大，传统食品又有着长久以来的食用基础，若能成功开发降糖功能食品，相较于其他动物源产品将更易被消费者接受，有着巨大的商业潜力。鱼类和乳类是当下降糖肽来源的研究热点，其中许多降糖肽的序列已经被鉴定出来，作用机制也逐步明晰，对于这些来源的降糖肽，应重点关注这些肽在人体内是否仍能保持原有的降糖活性，以及如何强化降糖肽在人体内的功效。在目前动物源性降糖肽的研究中，最明显的不足是人体试验数据较为匮乏，且部分研究发现人群直接食用含降糖肽的动物食品并不能有效地降低血糖，这可能是因为动物蛋白在体外与体内消化的环境与方式存在较大差异。因此，在开发动物源降糖肽的同时，也需要考虑如何使这些降糖肽更高效地在人体内发挥作用，并对患者症状起到明显的改善作用，这对动物源降糖肽成功实现商业化以及有效辅助治疗糖尿病有着重要意义。