血流感染中大肠埃希菌的药物敏感性、耐药基因及同源性分析

2022-11-11 12:04王海如侯亚彬李艳芳郝崇华
中国抗生素杂志 2022年9期
关键词:埃希菌氧氟沙星头孢

王海如 侯亚彬 李艳芳 郝崇华

(山西医科大学附属人民医院,山西省人民医院,太原 030001)

血流感染是一种非常严重的全身性疾病,常伴随着不良的临床结局,不仅增加了患者死亡率,延长了住院时间,还增加了医疗费用[1]。大肠埃希菌是引起血流感染的主要病原菌,2018年中国细菌耐药监测网(China Antimicrobial Surveillance Network,CHINET)数据显示,大肠埃希菌在血流感染病原菌中占23.1%[2]。有研究发现大肠埃希菌血流感染后 30 d的全因死亡率约为16%,并随着耐药性的增加而增加[3]。产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum betalactamases,ESBLs)是大肠埃希菌的主要耐药机制[4]。本文重点对血流感染大肠埃希菌进行耐药表型和分子流行学调查,为经验性用药和制定预防感染措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2019年10月至2020年9月山西省人民医院住院患者血培养中的大肠埃希菌,同一患者同一住院期间连续多次培养出大肠埃希菌时,只收集首次培养的菌株。总共收集到76株大肠埃希菌,其中男性患者34例,女性患者占42例,平均年龄(62.1±14.9)岁。

1.1.2 仪器与试剂

法国生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自动微生物分析仪及配套试剂,美国Bio-Rad公司的ST1000 PCR扩增仪,德国Bruker公司的MicroflexMALDI- TOF MS全自动生物质谱检测系统,英国Oxoid公司的药敏纸片及M-H培养基。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及药敏试验

用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行菌种鉴定,用VITEK-2 Compact和相应的AST-GN16药敏卡进行药敏试验和ESBLs确证试验。药敏结果参考CLSI M100[5]进行判读。大肠埃希菌ACTT25922和ACTT35218做质控菌株。

1.2.2 耐药基因检测

对表型确认为ESBLs阳性的菌株进行耐药基因的筛查,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测ESBLs基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1,-2,-8,-9,-25组、blaVEB、blaGES、blaOXA-1,-2,-10组和blaPER,引物序列见表1[6]。提取DNA模板采用煮沸法,参考Zhao等[7]的步骤,PCR扩增反应体系和扩增条件参照文献[6],将阳性产物送上海生工生物工程股份有限公司测序,测序结果在BLAST数据库比对,以确定其基因亚型。

表1 耐药基因引物序列及目的片段大小Tab.1 PCR primers of the drug resistance genes and size of the target fragments

1.2.3 多位点序列分型(MLST)

通过PCR扩增大肠埃希菌的7个管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA。在EnteroBase数据库中对管家基因序列进行在线比对,获得管家基因的序列号,形成相应的等位基因谱,最后进行序列型分析。

1.2.4 统计分析

采用SPSS 25.0进行统计分析。我们将分类变量的值表示为它们所属组的百分比。用卡方检验比较分类变量。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果

76株大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率最高,达到90.7%,其次是环丙沙星、头孢唑林、左氧氟沙星和头孢曲松,耐药率分别为69.7%、65.7%、63.1%和56.5%。对哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亚胺培南、阿米卡星和替加环素全部敏感。76株大肠埃希菌中产ESBLs的检出率为56.5%。产ESBLs菌株对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松全部耐药,对环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和庆大霉素的耐药率分别为86.0%、83.7%、65.1%和60.4%,不产ESBLs菌株耐药率最高的是氨苄西林,耐药率是78.7%,其次是环丙沙星、复方磺胺甲恶唑、庆大霉素和左氧氟沙星,耐药率分别为48.4%、45.5%、42.4%和36.3%。产ESBLs菌株对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.05),详见表2。

表2 血流感染大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药率Tab.2 The resistance rates of Escherichia coli causing bloodstream infections to common antibiotics

2.2 分子特征

2.2.1 ESBLs基因检测结果

在43株产ESBLs菌株中,总共检出71个耐药基因,其中仅携带一个ESBLs基因的有19株菌,携带两个ESBLs基因的有20株菌,携带3个ESBLs基因的有4株菌。检出率最高的是blaCTX-M-14(39.4%,28/71)基因,其次是blaTEM-1(28.2%,20/71)、blaCTX-M-15(14.1%,10/71)、blaOXA-1(9.8%,7/71)和blaCTX-M-55(8.5%,6/7 1)。未发现b l aSHV、b l aCTX-M-2,-8,-25组、blaGES、blaVEB、blaOXA-2,-10组或blaPER基因。

2.2.2 多位点序列分型(MLST)和GoeBURST分析

通过MLST分析,在76株分离株中鉴定出28种STs型。如图1所示,具体的STs型为ST131(19.7%,15/76)、ST69(15.7%,12/76)、ST38(7.8%,6/76)、ST1193(6.5%,5/76)、ST648(5.2%,4/76)、ST73(5.2%,4/76)、ST46(3.9%,3/76)、ST405(3.9%,3/76)、ST117(2.6%,2/76)、ST450(2.6%,2/76)、ST2003(2.6%,2/76)、ST2448(2.6%,2/76)和其他是1株菌的ST10、ST44、ST95、ST155、ST167、ST393、ST490、ST410、ST457、ST493、ST542、ST773、ST1163、ST1284、ST2179、ST4503型。在产ESBLs菌株中,以ST131(27.9%,12/43)为主,在不产ESBL菌株中,以ST69(24.2%,8/33)为主。

图1 最小生成树(MST),每个圆的面积对应于本研究的MLST数据中ST的出现频率Fig.1 Minimum spanning tree(MST),the area of each circle corresponds to the frequency of St in MLST data

3 讨论

耐药性细菌的出现和传播一直是公众关注的问题。研究报告显示,抗生素耐药性细菌每年在全世界造成大约70万人死亡,如果不采取有效行动,预计到2050年每年将造成1000万人死亡[8]。同济医院1998—2017年耐药监测数据显示大肠埃希菌产生ESBLs的比例显著增加,从1998—2002年的0增加到2008—2012年的76.2%[9]。不同医院之间的微生物流行病学和耐药率可能存在很大差异[10],临床医生在选择适当的抗菌素时应考虑当地微生物流行病学。本研究分析了山西省人民医院血流感染中大肠埃希菌的药物敏感性、耐药基因分布及菌株间的同源性特征。

本研究表明,大肠埃希菌对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星和左氧氟沙星等常用抗生素高度耐药,但对碳青霉烯类、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加环素全部敏感,与楼颂羔等的报道一致[11],建议这些药物作为早期经验治疗的选择。本研究中产ESBLs大肠埃希菌的检出率为56.5%,低于Ma等[12]报道的河南产ESBLs大肠埃希菌的检出率61.9%和Wang等[6]报道的上海产ESBLs大肠埃希菌的检出率67.8%,但是高于意大利产ESBLs大肠埃希菌的检出率37.6%[13]和日本产ESBLs大肠埃希菌的检出率26.1%[14]。不同地区大肠埃希菌产 ESBLs 检出率不同,这种差异形成的原因可能与不同医院对感染控制力度不同、使用抗生素情况不同以及各地卫生条件不同等因素有关[15]。

本研究中,76株大肠埃希菌中多重耐药菌株有56株,其中42株是产ESBLs大肠埃希菌,14株为不产ESBLs菌株。43株产ESBLs大肠埃希菌中40株携带blaCTX-M基因,这些菌株对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松全耐药,对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率高于80%。在全球范围内,大肠埃希菌中最常见的ESBLs基因类型是blaCTX-M基因[16],本研究的结果与之相符。在我们的研究中,blaCTX-M-14是blaCTX-M的主要亚型,其次是blaCTX-M-15和blaCTX-M-55,而在德国和荷兰[17-18]的研究显示,blaCTX-M-15是blaCTX-M的主要亚型,这表明,大肠埃希菌blaCTX-M基因的亚型分布存在地理差异。43株产ESBLs大肠埃希菌中有19株菌携带一个ESBLs基因,有20株菌同时携带两个ESBLs基因,有4株菌同时携带3个ESBLs基因,进一步证明我院大肠埃希菌耐药情况严重,多重耐药模式复杂。

GoeBURST分析结果表明,引起血流感染的大肠埃希菌并不是由独特的祖先背景进化而来的,存在遗传多样性。我们的结果显示,在产ESBLs菌株中主要的ST型是ST131型,ST131型是目前公认的全球流行性克隆群和多重耐药谱系之一[19],Ranjan等[20]的研究发现ST131型大肠埃希菌有更强的致病性和更好的生存能力,这有助于ST131的流行,产ESBLs大肠埃希菌数量的大量增加可能与ST131的克隆扩增有关[21]。本研究中80%的ST131型菌株携带blaCTX-M基因,说明ST131型与blaCTX-M有很强的相关性,这与Alireza等[22]的研究一致。我们的结果显示,在不产ESBLs菌株中,主要的ST型是ST69型,而荷兰van Hout等[23]的一项研究表明,ST73是不产ESBLs菌株中最常见的序列类型,与我们的研究不一致,这表明,不同地区大肠埃希菌的ST型分布存在明显差异。我们的研究还发现ST131型菌株对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和庆大霉素的耐药率高,ST69型菌株对氨苄西林、庆大霉素和复方磺胺甲恶唑的耐药率高,与Souza等[24]的研究结果一致,这表明不同ST型对不同药物的敏感性存在一定差异,临床需根据药敏实验结果选择合适的抗菌药物。

综上所述,本院大肠埃希菌对大多数常用抗生素具有耐药性。经验性用药,碳青霉烯类、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加环素可能是较好的选择。本院血流感染中大肠埃希菌主要流行的耐药基因型为blaCTX-M型,MLST分析表明,菌株间存在遗传多样性。合理使用抗生素和监测病原体的流行病学特征是必要的,以减少耐药细菌的扩散和流行。

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