高效液相色谱法测定醋酸来法莫林的有关物质

何美翠 张春然,* 黄清东 王宇驰 王瑛瑛 于瑶 张静霞 李知仪 赵欢 唐克慧

(1 抗生素研究与再评价四川省重点实验室，四川抗菌素工业研究所，药学院，成都大学，成都 610106；2 四川百特文理科技有限公司，成都 611731)

醋酸来法莫林(lefamulin acetate)为来法莫林的原料药，化学名为14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基环己基硫烷基]乙酰基}-截短侧耳素乙酸盐[1](图1)是第一个系统性给药的截短侧耳素类抗生素，为Nabriva公司开发研制。2019年8月19日成功在美国获批，后又相继在欧盟和加拿大获批，用于治疗成人社区获得性细菌性肺炎(CABP)[2]。商品名：Xenleta®，作为近20年来FDA批准的第一款具有独特作用机制的抗生素，其同时拥有两种剂型(静脉注射和口服)，在常见和难治性感染均具潜在疗效，未来具有广阔的应用空间[3]。醋酸来法莫林作为截短侧耳素药物具有独特的作用机制，与当前抑制细菌蛋白质合成的抗生素均不易产生交叉耐药性，因而在治疗社区获得性细菌性肺炎具有不可替代的作用。目前，各国药典及标准均未收载该药与其制剂的质量标准，同时醋酸来法莫林有关物质检测的方法未见文献报道。本文参考截短侧耳素类药物的分析方法，建立了适用于醋酸来法莫林有关物质测定的高效液相色谱法。

图1 醋酸来法莫林的结构式Fig.1 Structural formula of lefamulin acetate

1 仪器与试药

Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪；Agilent 1200 Serial液相色谱仪；岛津UV-2450紫外分光光度计；Sartorius BP211D型天平。

醋酸来法莫林粗品(批号：20200527)、样品(批号：20200915、20200929、20201029)；起始原料Ⅰ(截短侧耳素)，起始原料Ⅱ((R)-3环己烯甲酸)；中间体Ⅰ(S-((1R,2R,4R)-2-hydroxy-4-(2,2,2-trifluoroacetamido)cyclohexyl)benzothioate)，中间体Ⅱ(来法莫林)；试剂(硫代苯甲酸)。以上试药试剂均由四川百特文理科技有限公司提供；乙腈为HPLC级(美国Fisher)；水为纯净水(娃哈哈)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：中谱红PR-C18色谱柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)，流动相A：60 mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH至2.5)-乙腈(80:20，V/V)，流动相B：60 mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH至2.5)-乙腈(50:50，V/V)，梯度洗脱(表1)，流速1 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30℃，进样体积为20 μL。

表1 梯度程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

溶剂：乙腈:水(2:8，V/V)

供试品溶液：取醋酸来法莫林适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含5 mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每1 mL中含50 μg的溶液。

系统适用性溶液：精密称取醋酸来法莫林和起始原料Ⅱ各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1 mL中各约含0.5 mg的溶液。

灵敏度溶液：取系统适用性溶液适量，加溶剂稀释制成每1 mL中各约含2.5 μg的溶液。

2.3 有关物质测定

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图(图2)中，理论板数按来法莫林峰计算不得低于5000，来法莫林峰与起始原料Ⅱ的分离度大于1.5。灵敏度溶液色谱图(图2)中，主成分峰高的信噪比应不低于10。

测定法：以“2.1”项下的液相色谱方法，按“2.2”项配制供试品溶液和对照溶液，精密量取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～20%；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的液相色谱图(图2)中如显示杂质峰，均按不加校正因子的主成分自身对照法进行计算。

图2 醋酸来法莫林有关物质测定相关HPLC图Fig.2 Related HPLC chart for determination of related substances in lefamulin acetate

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察

(1)与原料、中间体、试剂的分离情况

取醋酸来法莫林样品(批号：20200915，方法学验证均用该批次)适量，再加入适量起始原料、中间体、试剂，加20%乙腈(起始原料或中间体溶解度差时可加乙腈溶解后，再加20%乙腈稀释至刻度)溶解并稀释制成每1 mL中约含5 mg醋酸来法莫林、25 μg来法莫林、10 μg中间体Ⅰ、5 μg硫代苯甲酸、25 μg(R)-3环己烯甲酸、50 μg的截短侧耳素的混合溶液。

(2)与降解杂质的分离情况

酸破坏：精密称取醋酸来法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 4 mol/L HCl溶液水浴60℃条件下破坏样品1 h，于该酸破坏溶液加入1 mL 4 mol/L NaOH溶液中和，用1 mL乙腈溶解样品，再以20%乙腈稀释至刻度。

碱破坏：精密称取醋酸来法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 1mol/L NaOH溶液水浴60℃条件下破坏样品1 h，于该碱破坏溶液加入1 mL 1 mol/L HCl溶液中和，加1 mL乙腈溶解样品，再以20%乙腈稀释至刻度。

氧化破坏：精密称取醋酸来法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 3% H2O2溶液于室温下破坏样品30 min，再以20%乙腈稀释至刻度。

高温破坏：取醋酸来法莫林适量，在高温(120℃)条件下放置4 h，取出后于干燥器中冷却至室温，精密称取样品适量，制成5 mg/mL的溶液。

高湿破坏：取醋酸来法莫林适量，于高湿环境(25℃，相对湿度(RH)为75%±5%)中放置10 d，精密称取样品适量，制成5 mg/mL的溶液。

光照破坏：取醋酸来法莫林样品适量，于ChP2020四部通则9001规定的光照强度(4500±500 Lx)下放置10 d，精密称取样品适量，制成5 mg/mL的溶液。

精密量取醋酸来法莫林供试品溶液以及上述6种破坏溶液各20 μL，按“2.1”项下的色谱条件分别进样检测并记录色谱图。相应图谱见图3，由试验结果可知，醋酸来法莫林于光照破坏、高湿破坏条件下较稳定，而在其余4种破坏条件下均会发生降解，其中氧化降解产生两个杂质(氧化降解杂质A和氧化降解杂质B，以下称杂质A和杂质B)，在上述的色谱条件下，起始原料、中间体及各降解产物均能与醋酸来法莫林主峰完全分离，证明所建方法专属性强。

图3 专属性试验HPLC色谱图Fig.3 The HPLC chromatogram of specificity test

2.4.2 线性

精密称取醋酸来法莫林样品适量于10 mL容量瓶，加20%乙腈溶解并稀释制成每1 mL约含5 mg的储备液。精密量取醋酸来法莫林储备液适量分别制成浓度为0.50、1.00、5.02、12.56、25.11、50.22和75.33 μg/mL的醋酸来法莫林溶液，按“2.1”项下液相色谱条件进样分析并记录谱图。以主峰峰面积(y)对醋酸来法莫林浓度(x)进行线性回归，回归方程：y=2113.4x-173.23，R2(相关系数)为1.000。由结果可知，醋酸来法莫林在0.50～75.33 μg/mL浓度范围内与峰面积呈较好的线性关系。

2.4.3 检测限和定量限

取醋酸来法莫林线性溶液逐步稀释，根据岛津LC solution QAQC计算操作步骤来计算信噪比(S/N)，以信噪比S/N=15.62对应的醋酸来法莫林浓度0.50 μg/mL为定量限，以信噪比S/N=7.73对应的醋酸来法莫林浓度0.20 μg/mL为检测限。

2.4.4 供试品溶液的稳定性试验

取醋酸来法莫林一定量，按“2.2”项制备供试品溶液，于室温放置0、1、2、4、6、8、10、12和24 h，按“2.1”项下色谱条件进样检测并记录谱图，供试溶液主峰峰面积RSD(相对标准偏差)值为0.31%，杂质A的RSD为0，杂质B含量的RSD值为1.44%，总杂质含量的RSD值为1.86%，表明醋酸来法莫林溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验

精密称取醋酸来法莫林样品6份，依照“2.2”项制备溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样检测并记录谱图，以醋酸来法莫林样品中杂质A、杂质B、最大单个未知杂质及总杂质的含量考察方法的精密度，杂质A的RSD值为0，杂质B的RSD值为1.74%，最大单个未知杂质的RSD值为0，总杂质的RSD值为1.39%。

2.4.6 中间精密度

以同一批醋酸来法莫林样品，按照“2.2”项制备溶液，在不同时间由不同分析人员分别在Shimadzu LC-20AB和Agilent 1200 Series仪器上按“2.1”项下的色谱条件进样检测，以醋酸来法莫林样品中的杂质A、杂质B、最大单个未知杂质及总杂质含量考察方法的中间精密度，杂质A的RSD值为0，杂质B的RSD值为1.99%，最大单个未知杂质RSD值为0，总杂质RSD值为1.47%。结果证明所建方法精密度较好。

2.4.7 耐用性试验

依照“2.2”项制备醋酸来法莫林供试品及对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样检测，分别考察流速、柱温、波长等条件有微小变化时，醋酸来法莫林的色谱行为，结果见表2。由表可知，样品测定条件有小的变动时，各项测定结果、杂质检出个数相同，证明所建方法耐用性较好。

表2 耐用性试验结果Tab.2 Durability test results

2.5 有关物质检查结果

按照“2.2”项制备醋酸来法莫林供试品及其对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，对3批醋酸来法莫林样品有关物质进行检查，检查结果见表3。根据结果可知，3批醋酸来法莫林样品的杂质A、杂质B、最大单个未知杂质含量、总杂质含量差别不大。

表3 醋酸来法莫林有关物质检查结果Tab.3 Test results of related substances of lefamulin acetate

3 讨论

3.1 色谱条件的选择与确定

洗脱程序的确定：参考截短侧耳素类药物的分析方法[4]，以磷酸盐-乙腈为流动相，等度洗脱，杂质与主峰未能分开；梯度洗脱，杂质与主峰能有效分离，调节梯度程序使各杂质与主成分的分离度提高。水相的确定：①磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、②磷酸氢二钾与磷酸二氢钾、③磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、④磷酸二氢钾、⑤磷酸氢二钠、⑥0.1%磷酸、⑦0.1%TFA(三氟乙酸)、⑧0.1%甲酸，发现水相中的盐离子可以使主峰的峰形收敛，不同的缓冲盐作为水相，检出杂质个数、相邻杂质之间的分离度均相差不大，使用钾盐比钠盐的基线平稳。综合考虑后，选用磷酸二氢钾作为缓冲盐。

3.2 检测波长的选择

取醋酸来法莫林粗品(批号：20200527)适量，精密称定，以水为稀释剂，制成1 mg/mL的溶液，在200～800 nm波长范围内进行光谱扫描，结果显示，醋酸来法莫林在203和244 nm处有最大吸收峰，在400～800 nm波长范围内无吸收。由于醋酸来法莫林样品243 nm波长处的吸收较小，杂质检出数目少；将检测波长改为210 nm时的吸收增大，且210 nm波长下检出的杂质较多，故我们初步将210 nm作为检测波长。采用二极管阵列检测器，对样品、破坏样品进行全波长扫描，所得图谱见图4；结果显示，在210 nm波长处，主峰、杂质峰的纯度因子均大于计算的阈值，表明各峰均为单峰，同时，在其他波长处未显示新的吸收峰，说明无杂质漏检。因此，选定能检出杂质最多、主峰和杂质峰均有较大吸收的210 nm作为检测波长。

图4 醋酸来法莫林的二极管阵列扫描图Fig.4 The diode array scannogram of lefamulin acetate

3.3 磷酸二氢钾溶液pH的选择

流动相中磷酸二氢钾溶液的pH为2.0、2.5、3.0、4.5和5.5，考察磷酸二氢钾溶液pH的变化对醋酸来法莫林(批号：20200527)主峰保留时间、主峰理论板数、主峰与邻近杂质峰分离度及杂质检出个数的影响。结果表明：pH5.5时，基线漂移严重。pH在2.0至4.5范围内随着缓冲盐pH值增加，检出杂质个数由8个变为7个，而主峰柱效、拖尾因子、主峰与邻近杂质峰之间的分离度均差异不大。综合考虑后选择pH为2.5。

3.4 磷酸二氢钾溶液浓度的选择

流动相中磷酸二氢钾的浓度分别为10、25、50、60、68和75 mmol/L，考察磷酸二氢钾浓度的变化对醋酸来法莫林(批号：20200527)主峰保留时间、主峰理论塔板数、拖尾因子及主峰与相邻杂质峰分离度的影响。结果表明，随着磷酸二氢钾溶液浓度的增加，拖尾因子降低，理论塔板数升高、主峰与相邻杂质峰分离度增加。当流动相中缓冲盐浓度达到60 mmol/L时，继续增加磷酸二氢钾溶液浓度，虽主峰理论板数稍有增加，但拖尾因子、主峰与邻近杂质峰分离度两个指标变化不大。综合考虑，将缓冲盐浓度定为60 mmol/L。

3.5 进样浓度的选择

取醋酸来法莫林(批号：20200527)适量，分别配制成浓度为1.0、2.5、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0 mg/mL的溶液，同法进样分析。结果显示，溶液浓度为5 mg/mL时，再继续增加样品浓度，检出的杂质个数不变，故将醋酸来法莫林有关物质检查浓度定为5 mg/mL。

3.6 杂质A、B分析

图6 杂质B的高分辨质谱图Fig.6 HR-MS chart of impurity B

在样品中，杂质B的归一化含量大于0.1%，根据ICH的文件Q3A和中国药典四部通则药品杂质分析指导原则，需要对该杂质进行研究。首先采用起始原料与中间体定位杂质，结果表明杂质A、B既不是原料也不是中间体；进而采用最后一步反应剩余的母液分析杂质来源，也未能成功定位归一化含量大于0.1%的杂质；最后根据降解试验产生的降解杂质分析杂质来源，其中氧化降解产生2个较大的杂质，两杂质与样品中归一化含量较大及该杂质前一相邻杂质保留时间一致。通过半制备高效液相色谱法收集杂质A溶液与杂质B溶液，再将所得的两溶液进行高分辨质谱分析，两杂质的高分辨质谱图见图5～6。两杂质的ESI正离子谱图显示其分子离子峰有m/z524.3023、546.2839、562.2574，分别对应[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+离子峰，表明其分子量为523，而来法莫林的分子量为507，氧化降解产生的两杂质刚好比来法莫林多了一个氧原子的分子量16，研究证明杂质A、杂质B为氧化降解杂质，结合醋酸来法莫林的结构与合成路线，推测杂质A、B可能为醋酸来法莫林硫醚键氧化成亚砜或碳碳双键环氧化的产物，结构见图7。在氧化剂(过氧化氢)存在的条件下，醋酸来法莫林结构中的硫醚键会被氧化成亚砜，碳碳双键则被氧化成环氧乙烷。结合醋酸来法莫林的合成路线分析样品中杂质A与杂质B的来源，推测是空气中的氧气将硫醚氧化成亚砜，有研究表明[5]在没有氧化剂的条件下可以利用氧气将硫醚氧化成亚砜，因空气中氧气占比较大，可能在反应过程中将硫醚氧化成亚砜。同理，碳碳双键环氧化也是空气中氧气的作用[6]。

图5 杂质A的高分辨质谱图Fig.5 HR-MS chart of impurity A

图7 杂质A或杂质B可能的结构Fig.7 Possible structure of impurity A or impurity B